卷枝毛霉Δ12-脱饱和酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

刘小琳,江贤章,张明亮,黄建忠

(1.福建师范大学闽南科技学院生命科学与化学系,福建泉州 362332;2.福建师范大学生命科学学院福建省现代发酵技术工程研究中心工业微生物教育部工程研究中心,福建福州 350108)

卷枝毛霉Δ12-脱饱和酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的高效表达

刘小琳,江贤章,张明亮,黄建忠*

(1.福建师范大学闽南科技学院生命科学与化学系,福建泉州 362332;2.福建师范大学生命科学学院福建省现代发酵技术工程研究中心工业微生物教育部工程研究中心,福建福州 350108)

Δ12-脱饱和酶是亚油酸合成的关键酶,为提高Δ12-脱饱和酶的活性,本研究利用RT-PCR对Mucor sp. EIM-10的Δ12-脱饱和酶cDNA进行克隆,并导入pYES2.0质粒中,构建重组表达载体。运用醋酸锂转化法将重组质粒导入酿酒酵母,成功构建pYMD12酿酒酵母表达系统。为了进一步提高Δ12-脱饱和酶的表达水平,用GAP启动子替代pYES2.0质粒自带的启动子,成功构建pYGAPMD12重组菌。最终产物经GC-MS检测显示,pYGAPMD12重组菌转化C18∶1的转化率为69.172%,比pYMD12重组菌提高32.771%。本文为进一步提高Δ12-脱饱和酶的表达水平提供参考依据。

Δ12-脱饱和酶,GAP启动子,酿酒酵母,卷枝毛霉

多不饱和脂肪酸(PUFAs)在机体内具有广泛的生理功能和生物学效应[1],亚油酸作为一种多不饱和脂肪酸,不仅具有降胆固醇和甘油三酯,预防动脉粥样硬化的作用,而且还是亚麻酸和花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的合成前体[2]。而Δ12-脂肪酸脱饱和酶[3-4]是脂肪酸生物合成途径中形成亚油酸(LA)的限速酶,在脂肪酸链C12与C13之间插入1个双键,催化油酸转变为亚油酸[5-6]。

酵母表达系统具有脂肪酸延长酶和脱饱和酶催化所需的各种因子,而且不存在脱饱和酶后的脂肪酸延长酶和脱饱和酶,适用作脱饱和酶的表达系统。酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVSc是一种尿嘧啶合成缺陷型菌株,在不含尿嘧啶的SC-U选择培养基上不能生长,而酿酒酵母表达质粒pYES2.0可以产生尿嘧啶,可以用来筛选阳性克隆子[7-8]。

图1 表达载体pYMD12和pYGAPMD12的构建Fig.1 Construction of pYMD12 and pYGAPMD12 vector

本文从Mucorsp.EIM-10中克隆Δ12-脱饱和酶cDNA基因,连接到pYES2.0质粒中,构建重组表达载体,并实现其在酿酒酵母中的表达,为进一步研究脱饱和酶的高效表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种与质粒Mucorsp.EIM-10 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶营养缺陷型INVSc1和pYES2.0载体 Invitrogen公司;pMD-18 Simple T载体 TAKARA公司。

1.1.2 培养基 Sc-U培养基:成分均购自Invitrogen公司,按其操作手册推荐方法配制;诱导培养基:在SC-U液体培养基中添加2%半乳糖。

1.1.3 主要试剂与仪器 ExTaq DNA聚合酶,限制性内切酶EcoR Ⅰ,XhoⅠ,KpnⅠ和BamH Ⅰ、T4连接酶 TaKaRa公司;亚油酸、棉子糖、Sc-U培养基所需各种氨基酸 sigma公司;其余试剂均为进口或国产分析纯,引物合成和测序由上海生工完成。

ABI2720 PCR仪 Amersham Biosciences;JS-380A自动凝胶图像分析仪 上海培清科技有限公司;高速台式冷冻离心机 Beckman;气质联用仪GC-MS 安捷伦。

1.2 实验方法

1.2.1 cDNA序列的克隆 利用Trizol法提取Mucorsp.EIM-10的总RNA。以总RNA为模板,以PC1(CCGGAATTCATGGCAACCAAGAGAAACG)和PC2(CCGCTCGAGTTAGTTCTTAAAGAAGACAACATCG)为上下游引物,通过RT-PCR扩增得到Δ12-脂肪酸脱饱和酶cDNA序列。PCR反应条件为:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,循环30次;72 ℃延长10 min;1.0%的琼脂糖凝胶电泳回收产物。

PC1和PC2引物是根据NCBI已报道的丝状真菌的Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因的保守序列进行设计,以Mucorrouxii delta-12 desaturasegene(登录号:AY533361)为模板,从头设计引物,并在PC1和PC2前分别添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.2.2 重组质粒pYMD12的构建与转化 pYES2.0载体和Δ12-脱饱和酶cDNA分别经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接,转化E.coliDH5α感受态细胞,运用氨苄抗性平板筛选得到阳性克隆子,命名为pYMD12重组质粒(图1)。运用醋酸锂转化法[9],将pYMD12转化酿酒酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株INVSc1感受态,以pYES2.0质粒为空白对照,涂布在Sc-U合成培养基,于28 ℃培养3 d,获得阳性克隆子。

1.2.3 重组质粒pYGAPMD12的构建与转化

1.2.3.1 GAP启动子的克隆 运用碱裂解法,提取毕赤酵母表达载体pGAPZα质粒[10]。以pGAPZα质粒DNA为模板,以Pgap1(CGGGGTACCAGATCTTT TTTGTAGAAATGTCTTGG)和Pgap2(CGCGGATCC ATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGG)为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min,72 ℃ 10 min;循环30次。

Pgap1和Pgap2引物是根据毕赤酵母表达载体pGAPZα中GAP启动子[11]的序列设计,并分别加入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点。

1.2.3.2 重组质粒的构建与转化 重组质粒pYMD12和GAP启动子片段分别于37 ℃水浴,用KpnⅠ和BamHⅠ进行双酶切,保温过夜,酶切产物经分别回收后,16 ℃连接过夜,将重组质粒命名为pYGAPMD12,如图1所示,并转化大肠杆菌,双酶切验证。转化和筛选方法同1.2.2。

1.2.4 重组质粒的表达 分别挑取SC-U平板上的阳性克隆子pYMD12,pYGAPMD12接种于2 mL SC-U液体培养基中,28 ℃,230 r/min振荡培养过夜;取2 mL接种于30 mL的SC-U液体培养基中,28 ℃,230 r/min振荡培养,运用分光光度计测量菌液OD600;培养至OD600=0.2～0.3时,接种pYMD12的培养基中添加2%半乳糖进行诱导,而接种pYGAPMD12的培养基不添加,分别转至25 ℃,230 r/min振荡培养72 h。

1.3 测定方法

分别离心收集菌体,提取总油脂并甲酯化,利用安捷伦6890N/5975MS气相色谱-质谱分析脂肪酸组成。GC-MS分析条件如下[12]:.气相色谱条件:气相色谱仪,HP-INNOWax polyethylene glycol极性柱(30.0 m×0.25 mm×φ0.25 μm)。柱加热程序:150 ℃维持1 min,150 ℃至210 ℃(10 ℃/min),210 ℃保持5 min,210 ℃至230 ℃(2 ℃/min),230 ℃保持4 min,240 ℃保持5 min。进样口温度:250 ℃,检测器温度:280 ℃,进样量:1 μL的,分流比:5∶1。质谱条件:质谱仪,检测器离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃;电离能70 eV,电离模式,EI;测量方式:全扫描,扫描范围:M/Z30-500,1.61scans/s;溶剂切除时间:3 min。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒pYMD12的构建

2.1.1 总RNA的提取 利用Trizol法提取Mucorsp.EIM-10总RNA,在2%琼脂糖凝胶上明显出现28S、18S两条带(图2),说明所提RNA的完整性好。

图2 卷枝毛霉EIM-10总RNAFig.2 Total RNA of Mucor sp. EIM-10

2.1.2 cDNA序列克隆 以Mucorsp.EIM-10总RNA为模板,经RT-PCR扩增到约1200 bp的cDNA序列(图3)。经NCBI序列比对发现,与Mucorrouxii(登录号:AF533361.1)同源性高达94%,且该片段具有完整的阅读框,说明cDNA克隆成功。

图3 cDNA序列克隆 Fig.3 Coloning of cDNA sequenceM:200 bp DNA marker;1，2：样品。

2.1.3 重组质粒pYMD12双酶切验证 运用EcoRⅠ和XhoI对筛选的阳性克隆子进行双酶切验证,如图4所示:双酶切结果显示两条清晰的条带且条带的位置与PCR克隆的结果一致,说明目的片段与pYES2.0载体成功连接。

图4 双酶切验证Fig.4 Digested identification M:200 bp marker;1,2:双酶切样品。

2.2 重组质粒pYGAPMD12的构建

2.2.1 GAP启动子克隆 以pGAPZα质粒DNA为模板,以Pgap1和Pgap2为引物,克隆的GAP片段约为500 bp,且条带单一。经序列比对,克隆片段与已报道的序列完全一致,说明GAP片段克隆成功,结果如图5:

图5 GAP启动子克隆Fig.5 Coloning of GAP promoterM：200 bp marker;1，2:GAP样品。

2.2.2 重组质粒pYGAPMD12双酶切验证 用kpnⅠ和BamHⅠ对重组质粒pYGAPMD12进行双酶切验证,结果显示两条清晰的条带且条带位置正确(图6),说明GAP启动子片段与pYMD12质粒成功连接。

图6 双酶切验证Fig.6 Digested identification M:1000bp marker;1:双酶切样品。

2.3 重组质粒pYMD12和pYGAPMD12的转化

2.3.1 重组酿酒酵母的筛选和鉴定 运用醋酸锂转化法将重组质粒pYMD12和pYGAPMD12分别转入酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc1,涂布在SC-U选择性培养基上,28 ℃培养3 d至转化子出现。挑取转化子进行菌落PCR验证,结果如图7、图8所示,PCR产物大小与预期一致,表明重组酿酒酵母构建成功。

图7 pYMD12转化子菌落PCR验证Fig.7 Identification of pYMD12 transformants by Colony PCRM:200bp marker;1，2:MD12样品。

图8 GAP转化子菌落PCR验证Fig.8 Identification of GAP by Colony PCRM:200 bp marker;1，2:GAP样品。

2.3.2 重组酿酒酵母的诱导表达 提取重组菌的总脂肪酸,并甲酯化,GC/MS分析结果显示:重组菌pYMD12出现了与亚油酸(C18∶2)甲酯标准品相对应的峰(保留时间为10.584 min),而空白对照没有出现此峰(图9)。通过质谱分析证明新出现的峰为亚油酸(十八碳二烯酸)甲酯(保留时间为10.584 min)(图10),说明在半乳糖的诱导下,重组菌pYMD12成功表达的Δ12-脱饱和酶,将底物油酸催化生成亚油酸。

另外,重组菌pYGAPMD12出现了与十六碳二稀酸(C16∶2)甲酯标准品相对应的峰(保留时间为8.115 min),而空白对照和重组菌pYMD12均没有出现此峰(图9)。通过质谱分析证明新出现的峰为亚油酸甲酯(保留时间为10.584 min),十六碳二稀酸(保留时间为8.115 min)(图10)。因此,无需诱导剂半乳糖的作用,重组菌pYGAPMD12表达的Δ12-脱饱和酶也具有催化效率。

图9 含有重组质粒的酵母脂肪酸甲酯的GC/MS分析Fig.9 GC/MS analysis of fatty acid methyl esters extracted from transformed yeast containing pYMD12

图10 脂肪酸成分质谱鉴定Fig.10 Identification of fatty acid compositions by mass spectrometry

综上,由于强启动子GAP的引入,重组菌pYGAPMD12相比重组菌pYMD12的优势在于无需诱导剂半乳糖的诱导,且重组菌pYGAPMD12可以催化十六碳一稀酸(C16∶1)生成十六碳二稀酸(C16∶2)。

2.3.3 脂肪酸转化效率 内源油酸(C18∶1)在Δ12-脱饱和酶的催化下生成亚油酸(C18∶1)的转化效率为:转化效率=产物/(底物+产物)×100%。由此可知从油酸到亚油酸,重组菌pYMD12和pYGAPMD12表达的Δ12-脱饱和酶的转化效率分别为36.401%和69.172%。另外,重组菌pYGAPMD12催化十六碳一稀酸(C16∶1)生成十六碳二稀酸(C16∶2)的转化效率为32.943%,而重组菌pYMD12不能催化十六碳一稀酸(C16∶1),结果如表1所示。

表1 各表达载体脂肪酸转化效率

3 结论

本文成功地从Mucor sp.EIM-10中获得Δ12-脱饱和酶cDNA序列,并将该序列导入pYES2.0载体中,构建成功pYMD12重组质粒。运用醋酸锂转化法成功将pYMD12重组质粒转化进酿酒酵母营养缺陷型菌株INVSc1中,从SC-U缺陷型平板中筛选得阳性克隆子,提取总脂肪酸进行GC-MS检测分析,结果显示:内源油酸(C18∶1)在Δ12-脱饱和酶的催化下生成亚油酸(C18∶1)的转化效率为36.401%。

为了进一步提高表达量,用毕赤酵母表达载体pGAPZα上的GAP强启动子替代pYES2.0质粒自带的启动子,成功构建pYGAPMD12表达载体。转化表达,提取总脂肪酸进行GC-MS检测分析,结果显示:无需半乳糖诱导,pYGAPMD12转化C18∶1的转化率为69.172%,相对pYMD12,转化率提高了32.771%,而且pYGAPMD12可以转化C16∶1,转化效率为32.943%。

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Cloning and high expression of Δ12-desaturase genes fromMucorcircinelloidesEIM-10

LIU Xiao-lin,JIANG Xian-zhang,ZHANG Ming-liang,HUANG Jian-zhong*

(1.Department of Chemistry and Life Science,Minnan Science and Technology Institute Fujian Normal University,Quanzhou 362332,China；2.Engineering Research Center of Industrial Microbiology,Engineering Research Center of Fujian Modern Ferment Technology,Ministry of Education,College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350108,China)

Δ12-desaturase plays an important role in the biosynthesis of linoleic acid inMucorspEIM-10. To improve enzymatic on the Δ12-desaturase activity,a recombinant expression vector was constructed. The Δ12-desaturase gene was cloned by RT-PCR technology. The PCR products were ligated into pYES2.0 plasmid. And then the recombinant plasmid(pYMD12)was transformed intoSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1 by lithium acetate method. To improve enzymatic activity,built-in promoter of pYES2.0 was replaced by GAP promoter,another new recombinant expression(pYGAPMD12)were constructed inSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1. Gas chromatography analysis showed that conversion efficiency of pYGAPMD12 was 69.172% and the conversion efficiency of pYMD12 was 36.401%. This paper was provided important reference for further stay of Δ12-desaturase.

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0196-05

2015-01-12

刘小琳(1987-)，女，硕士，助教，研究方向：微生物学，E-mail：liuxiaolin19872@163.com。

*通讯作者:黄建忠(1966-)，男，博士，教授，研究方向：微生物学，E-mail：hjz@fjnu.edu.cn。

福建省发改委产业化项目(闽教发[2010]77号)。

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.032