双酶梭菌TK6的筛选及益生物质对其代谢活力的影响

李敬杰，刘金辉，王海宽（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

双酶梭菌TK6的筛选及益生物质对其代谢活力的影响

李敬杰，刘金辉，王海宽
（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

本实验采用倾注法从健康成年人的粪便中筛选双酶梭菌（Clostridium bifermentans）TK6，该菌有益于反刍动物，其发酵产物有消化酶、短链脂肪酸以及α-酮异己酸（KIC）等益生物质.分别利用7种低聚糖（低聚葡萄糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、棉籽糖以及水苏糖）为唯一碳源进行TK6的对比发酵，测定其不同发酵液中短链脂肪酸、异丁酸、α-酮异己酸、消化酶等益生物质的含量.实验结果表明：不同低聚糖作为唯一碳源对TK6的生长促进程度不同，并对其产生的水解酶、短链脂肪酸等物质有不同的影响.菌株TK6利用低聚异麦芽糖为唯一碳源时，其活菌数最大，为（7.97±0.16）×108，mL-1；并且其产乙酸、丁酸的促进作用最大，分别为（65.70±0.37）mmol/L和（53.51±0.52）mmol/L；产纤维素酶活力最高，达到（1，994.84±254.52）U/mL.菌株利用低聚木聚糖为唯一碳源时，其发酵液产木聚糖酶的酶活力最高，为（135.86±1.82）U/mL；利用低聚果糖为唯一碳源时，其发酵液蛋白酶活力最高，为（10.12±4.34）U/mL.当添加150，mmol/L的L-亮氨酸，37，℃孵化4，h时，KIC产量最高为（8.18±0.06）mg/L.

双酶梭菌；功能性低聚糖；短链脂肪酸（SCFA）；水解酶

反刍动物经过长期进化形成了依靠瘤胃微生物的发酵作用降解、利用饲料的消化系统.有报道指出瘤胃微生物对反刍动物机体的蛋白质和糖类代谢、维生素合成消化、降解低聚糖以及发酵产生短链脂肪酸提供能量等都有相当重要的作用［1］.用芽胞杆菌菌制剂饲喂奶牛，可改善牛乳的质量，并可显著增加产奶量；饲喂犊牛，可显著增加犊牛的日增重，以及提高对犊牛的大肠杆菌性下痢的治愈率；饲喂绵羊，可增加绵羊对纤维素的利用率［1-3］.双酶梭菌代谢产物范围很广，包括各种有机分子等碳水化合物、有机酸、醇类、芳香族化合物、氨基酸、胺类、嘌呤和嘧啶［4］.双酶梭菌是嗜温细菌，严格厌氧，革兰氏阳性，产芽胞，芽胞卵圆，中到次端生，有一个厚的芽胞壁，发酵产丁酸、异丁酸与消化酶，耐酸碱、高温，耐受饲料的加工储藏与胃的酸性环境等，在肠道内可萌发为有新陈代谢作用的益生细胞，其发酵液中含有较高活性的消化酶，对植物碳水化合物有较强的降解能力，并能提高饲料转化率，是优良的益生菌候选者［5］.因此，双酶梭菌替代抗生素添加到反刍动物的饲料中，是本实验研究的目标方向.益生菌、有机酸、酶制剂等微生态制剂调控反刍动物的营养代谢途径，并对改善瘤胃发酵、促进动物生长、提高免疫力有一定功效，是潜在的抗生素替代产品［6-7］.

本文从健康成年人的粪便中筛选高产酶与短链脂肪酸（SCFA）益于反刍动物的双酶梭菌，测定双酶梭菌利用7种低聚糖发酵结果，并对产生的各种益生物质进行测定，旨在为双酶梭菌合生元的开发以及反刍动物的候选益生菌提供了理论基础与应用依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品

取天津本地的23～30岁健康成年人的新鲜粪便约10，g，溶于90，mL灭菌后的生理盐水中，稀释均匀.

1.1.2 培养基

计数培养基（g/L）［8］：葡萄糖5.0，蛋白胨20.0，琼脂10.0，pH 7.4.

BHI培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0，牛心浸粉17.5，NaCl 5.0，葡萄糖2.0，K2HPO4·12H2O 2.5，pH 7.4，121，℃灭菌20，min.

RCM培养基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉粉10.0，酵母粉3.0，葡萄糖5.0，可溶性淀粉1.0，NaCl 5.0，醋酸钠3.0，L-半胱氨酸盐酸盐0.5，琼脂0.5，pH 6.8，121，℃灭菌20，min.

低聚葡萄糖（glucoseoligosaccharides，GLOS）培养基（g/L）：低聚葡萄糖5，蛋白胨10，K2HPO45，MgSO40.2，MnSO40.2，pH 7.4，115，℃灭菌20，min.

分别用低聚半乳糖（galatooligosaccharides， GOS）、低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharides，IMOS）、低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）、低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）、水苏糖及棉籽糖替代种子培养基中的低聚葡萄糖（GLOS）作为唯一碳源，其他成分不变.实验用功能性低聚糖的组成与结构见表1.

表1 实验用功能性低聚糖组成与结构Tab. 1Composition and structure of functional oligosaccharides

1.2 实验方法

1.2.1 倾注法筛选

用灭菌吸量管吸取样品1，mL，注入含有9，mL生理盐水的试管中，另换1支1，mL灭菌吸量管反复吹吸数次，此液为1﹕10稀释液。按上述操作顺序做10倍递增稀释液。吸取10-5、10-6、10-7这3个梯度稀释液于已灭菌的平板中，每个稀释度做3个平板，然后将冷却至50，℃左右的RCM固体培养基注入平板中，并转动平板使之与样液混匀，待培养基凝固后，37，℃厌氧培养（H2、CO2与N2的体积比为1﹕1﹕8）12，h.反复两次挑取单菌落，直至平板上只含有大小形态都相同的单一菌落.挑取单菌落于10，mL的BHI液体培养基试管中，37，℃厌氧培养（H2、CO2与N2的体积比为1﹕1﹕8）19，h，1﹕1保存于60%，的甘油管中，-70，℃冰箱保存.

1.2.2 提取基因组，PCR扩增16S，rDNA测序

采用酚氯仿抽提法提取分离菌株的基因组，菌株TK6通过16S rDNA方法鉴定。筛选分离出的菌株由北京六合华大基因技术有限公司进行16S rDNA测序.使用NCBI BLAST软件在DDBJ/EMBL/Gen-Bank中使用参考菌株同源性进行搜索.

1.2.3 活菌计数

取1，mL样品用9，mL的无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取1，mL适当的稀释梯度于装有9，mL的计数培养基的厌氧管内，37，℃厌氧培养36，h［8］.

1.2.4 发酵上清液的制备

从甘油管中接0.1%，的菌体于10，mL BHI液体培养基中，厌氧培养19，h后，振荡混匀，取2，mL菌液于装有40，mL不同功能性低聚糖的液体培养基的50，mL的圆底烧瓶中，厌氧培养32，h.取5，mL的液体于5，mL的EP管中，12，000，r/min离心10，min，取上清液，即为发酵液.

1.3 菌株TK6的发酵产物测定

1.3.1 消化酶活性的测定

采用GB/T 23527—2009，Folin试剂显色法测蛋白酶活性［9］，采用CMC-糖化力法测定纤维素酶活性［10-11］，参考王振华［1］的方法测定木聚糖酶活性.

1.3.2 短链脂肪酸（SCFA）浓度的测定

参考Wang等［8］的方法进行发酵样品处理，SCFA标准品混合物包括乙酸、丁酸、异丁酸，采用外标法绘制标准曲线，确定样品中SCFA浓度［12］.

1.3.3 α-酮异己酸（KIC）含量的测定

双酶梭菌于10，mL BHI液体培养基中，厌氧培养19，h后，取2，mL菌液转接于40，mL的发酵培养基中（做5组对照），37，℃厌氧培养24，h.在超净台中分别向5个圆底烧瓶中加入不同浓度的前体物L-亮氨酸（25、50、75、100、150，mmol/L），厌氧培养1、2、3、4、5，h后，分别取1，mL，离心取上清液，过膜处理.利用紫外高效液相色谱法测定KIC含量［13］.

2 结果与分析

2.1 双酶梭菌的分离鉴定

实验通过倾注法分离培养后分离出11 株单菌落.根据《伯杰细菌鉴定手册》［14］，双酶梭菌为革兰氏阳性（G+）菌，严格厌氧，菌体直或微弯，产芽胞，芽胞卵圆，偏心到次端生，菌株 B2、B6、C7、TK6符合要求.将得到的 4组序列在NCBI 数据库中进行16S rDNA 序列同源性比对，B2、B6、C7、TK6与双酶梭菌（C. bifermentans）的同源性分别达98%、99%、98%、100%，均属于梭菌属双酶梭菌种.由于菌株TK6同源性达到100%，且等同条件下生长最旺盛，因此本文选定TK6进行深入研究.

2.2 双酶梭菌TK6体外发酵

2.2.1 不同功能性低聚糖对双酶梭菌TK6菌体浓度的影响

功能性低聚糖不同的单体组成和结构影响其在肠道的发酵与SCFA的合成［15］，双酶梭菌TK6对不同功能性低聚糖的微生物利用率可以通过发酵结束获得的菌体浓度来判断，结果见表2.

表2 不同功能性低聚糖对双酶梭菌TK6菌体浓度的影响Tab. 2Effect of different functional oligosaccharides on the growth of C. bifermentans TK6

不同的低聚糖结构显著影响双酶梭菌TK6的发酵效果，实验中7种功能性低聚糖都能被双酶梭菌TK6不同程度利用，`其中，IMOS与GOS表现出对益生菌双酶梭菌TK6显著的促生长益生功能。双酶梭菌TK6发酵IMOS获得的菌体浓度最高，达到（7.97±0.16）×108，mL-1，利用GOS获得的菌体浓度高于棉籽糖和水苏糖，而对FOS以及XOS的利用率不高.

2.3 双酶梭菌TK6体外发酵水解酶活性

分别利用7种低聚糖为碳源发酵后，测定纤维素酶活力，结果如图1所示.由图1可知，菌株利用IMOS时，其发酵液产纤维素酶活力最高，达到（1，994.84±254.52）U/mL，其次是GOS与XOS，产量分别达到（1，536.69±203.62）U/mL与（811.30± 139.98）U/mL，可能是IMOS、GOS与XOS都有α-1，4糖苷键.分别利用7种低聚糖为碳源发酵后，测定纤维素酶活力，结果如图2所示，菌株利用XOS发酵产木聚糖酶的酶活力最高，为（135.86± 1.82）U/mL。木聚糖的单体主要为木糖，木聚糖酶水解以木糖为底物.分别利用7种低聚糖为碳源发酵后，测定蛋白酶酶活力，结果如图3所示，利用FOS发酵时，蛋白酶酶活力最高为（10.12±4.34）U/mL.

图1 利用7种低聚糖测定纤维素酶活力Fig. 1Cellulase activity using seven functional oligosaccharides

图2 利用7种低聚糖测定木聚糖酶活力Fig. 2 Xylanase activity using seven functional oligosaccharides

图3 利用7种低聚糖测定蛋白酶活力Fig. 3 Protease activity using seven functional oligosaccharides

由图1—图3可知，双酶梭菌同时具有蛋白酶、纤维素酶与木聚糖酶的活性，杨胜坤等［7］报道双酶梭菌制剂饲喂家兔，促进家兔的生长与肠道消化酶活性的增强，提高饲料的利用率.王振华［1］认为芽胞杆菌制剂提高反刍动物消化酶活性是微生态制剂促进反刍动物生长作用的一个重要因素.双酶梭菌TK6厌氧发酵产生的水解酶可以降解饲料中的植物粗纤维、蛋白质、碳水化合物、脂肪、淀粉、可溶性糖及纤维素，改善其吸收方式，提高饲料营养成分的转化率，获得生长、繁殖所需能量和各种营养物质，间接固定粗纤维的能量，促进反刍动物生长［16］.双酶梭菌TK6有望作为良好的益菌制剂添加到反刍动物的饲料中. 2.4 双酶梭菌TK6体外发酵不同功能性低聚糖产短链脂肪酸的特点双酶梭菌TK6发酵不同种类的功能性低聚糖短链脂肪酸终产物主要是乙酸和丁酸（图4），并以乙酸为主.功能性低聚糖的不同种类对异丁酸的产量影响不显著，相比于对照组及其他功能性低聚糖，双酶梭菌TK6对IMOS的发酵产生相对最高的乙酸和丁酸，分别达到（65.70±0.37）、（53.51±0.52）mmol/L；其次是GOS与水苏糖，其乙酸与丁酸产量均较高，乙酸产量分别为（58.53±0.81）、（49.06±0.43）mmol/L，丁酸产量分别为（42.90±0.47）、（34.36± 0.10）mmol/L；对GLOS、XOS与FOS的利用率较低.数据显示，丁酸梭菌TK2发酵不同功能性低聚糖代谢产生的短链脂肪酸量与菌体浓度成正相关［8］，同时，再一次证明了双酶梭菌TK6对XOS与FOS两种功能性低聚糖的利用率不高.

图4 双酶梭菌TK6利用功能性低聚糖产乙酸、丁酸、异丁酸Fig. 4C. bifermentans TK6，using functional oligosaccharide production acetate，butyrate and isobutyrate

双酶梭菌利用7种低聚糖发酵产生大量的短链脂肪酸，产生的乙酸含量最高.Prohaszka等［17］报道乙酸能提高奶牛的泌乳量，特别是显著提高乳脂率.反刍动物从消化道中吸收的碳水化合物主要是SCFA，SCFA约占反刍动物吸收能量的70%～80%，而乙酸是产量最大的SCFA.王振华［1］报道有机酸使肠道中的pH、EH值维持在较低的水平，有利于菌体摄取更多的营养促进生长，同时可激活酸性蛋白酶的活性，促进矿物质磷、铁、钙及维生素D的吸收，提高饲料利用率.张振威等［18］报道西门塔尔牛日粮中添加异丁酸后，有机物、粗蛋白的消化率以及日增重显著高于对照组，肉牛干物质采食量显著低于对照组，日粮添加异丁酸后对西门塔尔牛增重性能、营养物质消化和降低甲烷排放等都有显著促进作用.

2.5 双酶梭菌TK6产KIC的特性

双酶梭菌产KIC的产量与底物L-亮氨酸、孵化时间有关（图5）.当添加150，mmol/L的L-亮氨酸37，℃孵化4，h时，双酶梭菌产KIC的产量最高为（8.18±0.06）mg/L.在动物生产中添加KIC增加蛋白质含量并促进家畜生长.Flakoll等［19］用瘤胃保护性α-酮异己酸钙盐饲喂阉牛和羔羊，发现动物日增量增多，提高了饲料转化率.Kuhlman等［20］研究发现瘤胃保护性KIC的添加可增强羔羊淋巴细胞增殖反应以及抗猪红细胞抗体反应.Nissen［21］还发现KIC对家畜乳脂的分泌具有促进作用.

图5 双酶梭菌TK6产KICFig. 5 Production of KIC using C. bifermentans TK6

3 结 论

双酶梭菌TK6发酵不同功能性低聚糖，短链脂肪酸终产物主要是乙酸和丁酸，功能性低聚糖的种类对异丁酸的产量影响不显著，相比于其他功能性低聚糖，TK6发酵IMOS产生相对最高的乙酸和丁酸，分别为（65.70±0.37）mmol/L和（53.51±0.52）mmol/L.当添加150，mmol/L的L-亮氨酸37，℃孵化4，h时，TK6产KIC量最高为（8.18±0.06）mg/L.菌株TK6分别利用IMOS、XOS、FOS时，其发酵液中纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶活力达到最高，为（1，994.84± 254.52）、（135.86±1.82）、（10.12±4.34）U/mL.双酶梭菌TK6耐酸碱、耐高温、耐受饲料的加工储藏与胃的酸性环境等，在肠道内可萌发为有新陈代谢作用的益生细胞，其发酵液中含有较高活性的蛋白酶、纤维素酶，对植物碳水化合物有较强的降解能力，并能提高饲料转化率，降低反刍动物的致病率，为工业化生产降低成本.双酶梭菌可以作为反刍动物的候选益生菌，动物实验有必要进一步验证.

［1］ 王振华. 高产酶活芽胞杆菌筛选及对奶牛生产性能影响的研究［D］. 雅安：四川农业大学，2006.

［2］ Kozasa M. Toyocerin（Bacill us toyoi）as growth promotor for animal feeding［J］. Microbiologie Aliments Nutrition，1986，4（2）：121-135.

［3］ 朱曲波，秦泽荣，席振强，等. 在奶牛日粮中添加微生态制剂降低牛奶中体细胞的比较试验［J］. 贵州畜牧兽医，2004，28（2）：1-2.

［4］ Leja K，Myszka K，Olejnik-Schmidt A K，et al. Selection and characterization of Clostridium bifermentans strains from natural environment capable of producing 1，3-propanediol under microaerophilic conditions［J］. African Journal of Microbiology Research，2014，8（11）：1187-1197.

［5］ Gomez-Gil B，Roque A，Tumbull J F，et al. A review on the use of microorganisms as probiotics［J］. Revista Latinoamericana de Microbiología，1998，40（3/4）：166-172.

［6］ 杨晋辉，周凌云，赵芸君，等. 反刍动物抗生素替代物的研究进展［J］. 中国畜牧兽医，2011（7）：162-167.

［7］ 杨胜坤，潘康成，吴敏峰. 双酶梭菌制剂对家兔生长和消化酶活性的影响［J］. 贵州农业科学，2009，37（8）：137-139.

［8］ Wang Haikuan，Shi Yan，Zhang Shuli，et al. The vitro fermentation of six functional oligosaccharides by Clostridium butyricum TK2 and Clostridium butyricum CB8［J］. Food Science and Technology International，2014，20（5）：1005-1011.

［9］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. GB/T 23527—2009蛋白酶制剂［S］. 北京：中国标准出版社，2009.

［10］ 王键. 利用分光光度法测定纤维素酶中Cx酶活力［J］.河南农业科学，2000（10）：31-32.

［11］ 刘德海，杨玉华，安明理，等. 纤维素酶酶活的测定方法［J］. 中国饲料，2002（17）：27-28.

［12］ Bailey M J，Biely P，Poutanen K. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity［J］. Journal of Biotechnology，1992，23（3）：257-270.

［13］ 祝玉洪. 不透明红球菌生物合成α-酮异己酸的研究［D］. 无锡：江南大学，2010.

［14］ 布坎南 R E，吉本斯N E. 伯杰细菌鉴定手册［M］. 9版. 北京：科学出版社，1995.

［15］ Nilsson U，Nyman M. Short-chain fatty acid formation in the hindgut of rats fed oligosaccharides varying in monomeric composition，degree of polymerisation and solubility［J］. British Journal of Nutrition，2005，94（5）：705-713.

［16］ 王中华. 反刍动物挥发性脂肪酸中间代谢［J］. 草食家畜，1995（2）：23-34.

［17］ Prohászka L，Jayarao B M，Fábián A，et al. The role of intestinal volatile fatty acids in the Salmonella shedding of pigs［J］. Journal of Veterinary Medicine Series B，1990，37（8）：570-574.

［18］ 张振威，王聪，刘强，等. 异丁酸对西门塔尔牛增重、日粮养分消化和甲烷排放的影响［J］. 草业学报，2014，23（1）：346-352.

［19］ Flakoll P J，Vandehaar M J，Kuhlman G，et al. Influence of alpha-ketoisocaproate on lamb growth，feed conversion，and carcass composition［J］. Journal of Anlmal Science，1991，69（4）：1461-1467.

［20］ Kuhlman G，Roth J A，Flakoll P J，et al. Effects of dietary leucine，alpha-ketoisocaproate and isovalerate on antibody production and lymphocyte blastogenesis in growing lambs［J］. Joumal of Nutrition，1988，118（12）：1564-1569.

［21］ Nissen S L. Method of feeding ketoisocaproate to lactating domestic mammals：U.S.，4758593［P］. 1988-07-19.

责任编辑：郎婧

Screening Clostridium bifermentans Strain TK6 and the Effect of Prebiotics on its Metabolic Activity

LI Jingjie，LIU Jinhui，WANG Haikuan
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Clostridium bifermentans TK6（C.bifermentans TK6）is a prebiotic of ruminant，whose fermentation products contain digestive enzyme，short chain fatty acid（SCFA）and α-ketoisocaproate（KIC）.It was screened from feces of healthy adults with the overlay method.Seven functional oligosaccharides，glucoseoligosaccharides（GLOS），fructooligosaccharides（FOS），galactooligosaccharides（GOS），xylooligosaccharides（XOS），isomaltoolig-osaccharides（IMOS），raffinose and stachyose，as the sole carbon source，were fermented respectively by C.bifermentans TK6 and contrasted. And then，the prebiotic content of each fermention product including SCFA，isobutyrate，KIC and hydrolase was checked.The results showed that each type of oligosaccharides as a sole carbon source has different effects on the growth of TK6 and the yield of hydrolase and SCFA.There is a significant increase of TK6 in IMOS，and the viable count is（7.97±0.16）×108mL-1.The production of acetate and butyrate reached（65.70±0.37）mmol/L and （53.51±0.52）mmol/L，respectively.Moreover，the cellulase activity reached（1，994.84±254.52）U/mL.Fermentation of XOS by TK6 resulted in the highest xylanase activity（135.86±1.82）U/mL，and the highest protease activity using FOS was（10.12±4.34）U/mL.The highest production of KIC was（8.18±0.06）mg/L while adding 150 mmol/L L-leucine and hatched 4 h at 37 ℃.

Clostridium bifermentans；functional oligosaccharides；short chain fatty acids（SCFA）；hydrolases

Q93

A

1672-6510（2016）03-0031-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150100

2015-08-05；

2015-12-31

李敬杰（1990—），女，天津人，硕士研究生；通信作者：王海宽，教授，hkwang@tust.edu.cn.