化学振荡法测定绿茶中茶多酚的含量

赖红伟，曹宏梅，王宇卓，杜鹃，蒋金鑫，姜涛，陶然，董顺福

（吉林医药学院，吉林吉林132013）

化学振荡是目前非线性化学反应动力学研究的重要内容，且一直是物理化学研究的热点之一。它与普通的化学反应不同，各组分浓度随时间不是单调地变化，而是会随时间或空间位置发生周期性的变化[1]。这种规律性的变化与一些生物振荡现象（如心脏跳动、钙振荡和糖酵解等）极其类似，因而使人们逐渐认识到生命现象和非生命现象之间遵循着某种相似的规律[2-3]。在均相的化学振荡反应中，由于B-Z振荡具有简单、稳定的特点，因此被广泛应用于化学、食品和药物分析等许多领域，并取得了一些重要进展[4]。B-Z振荡的反应现象虽简单，但反应机理却较为复杂，其中可能涉及到的基元反应多达二十个，目前普遍为人们所接受的是著名的FKN机理[5]。当振荡反应进行到某个阶段时，向体系中加入某种待测物，若该物质与该阶段的某个反应物或产物发生反应，则必然会影响振荡参数（如振荡周期、振幅和诱导期等）的变化。随被测物加入量的增大，所引起的变化值也随之增大，据此就可对一些物质进行定性和定量分析[4]。

茶多酚（tea polyphonels，简称TP）是一种从天然植物茶叶中提取的多羟基酚类衍生物的混合物，其中含量最高的是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），约占60%～80%。研究表明，这种多酚类物质具有优异的抗氧化性能和显著清除自由基的能力[6]。茶多酚产品的应用已有近20年的历史，其中高纯度的茶多酚主要用于医药行业，而一般纯度的茶多酚则用于食品、保健品和化工等领域[7-8]。所以，有关茶多酚的分析测试就显得十分重要。

茶多酚是由30多种含酚羟基的物质组成的一类混合物，因此茶多酚标准品的组成很难确定。目前国际上均采用没食子酸（GA）作为标准品来定量茶多酚的含量，为此本研究也采用了没食子酸作为标准品来测定绿茶中的茶多酚含量。本文中研究了茶多酚对经典的B-Z振荡体系的影响行为，建立了一种低成本、耗时短、易操作和高灵敏度的测定茶多酚含量的新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

没食子酸标准品（AR）：天津市光复精细化工研究所；绿茶：吉林市多客源超市；丙二酸、溴酸钾、浓硫酸、硫酸铈铵：分析纯；水为二次蒸馏水。

索式提取器；新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；申科R-205型旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司；SHZ-D（III）型循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；W201D型恒温水浴锅：上海申顺生物科技有限公司；FA1104N型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；ZH-1C型超级恒温水浴：南京多助科技发展有限公司；KH5200DB型数控超声波清洗器：麗山水利超声有限公司；BZ振荡实验装置：南京多助科技发展有限公司；HJ-1型磁力搅拌器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；232型饱和甘汞电极：上海越磁电子科技有限公司；213型铂片电极：天津市兰立科化学电子高技术有限公司；玻碳电极：上海辰华仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 B-Z振荡体系的建立

在100 mL恒温夹套玻璃反应容器中，以铂电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极。首先加入一定浓度的丙二酸、H2SO4和KBrO3水溶液各15.00 mL，搅拌均匀，同时设定温度为37℃，至少恒温10 min。然后再加入已恒温的一定浓度的硫酸铈铵水溶液15.00mL，混合液总体积固定为60.00 mL，与此同时用B-Z振荡试验装置记录电位（E）-时间（t）曲线。

1.2.2 绿茶中茶多酚的提取

将茶叶烘干，粉碎后，过40目筛，装瓶待用。称取5.0 g并用滤纸包包好置于索氏提取器中。首先用50%（体积分数）的乙醇浓度140 mL，提取2 h；然后将粗提液旋转蒸发至20 mL，在1 000 r/min的转速下离心去掉残渣；然后用等体积石油醚萃取3次。上述萃取液再继续加入一定体积的超纯水旋蒸数次，直至除掉乙醇及乙酸乙酯等有机溶剂，最后定容至100 mL容量瓶中，即得茶多酚提取液。

1.2.3 没食子酸（或茶多酚）对B-Z振荡体系的振动

待B-Z振荡体系达稳定后，分别在诱导期处，第7个波峰和波谷处加入一定浓度的没食子酸水溶液，观察电位（E）-时间（t）的变化，从而建立测定茶多酚的没食子酸标准曲线。

基于没食子酸对B-Z振荡体系的扰动规律，在指定位置处加入一定浓度的绿茶提取液，同时记录其E-t曲线，根据振荡周期的改变量来确定绿茶提取液中茶多酚的浓度。

2 结果与讨论

2.1 反应条件对振荡图谱的影响

试验表明，振荡体系中各组分的浓度变化是影响分析测定时的灵敏度和精密度的主要因素。为了获得规则稳定的振荡曲线，在之前的研究工作中，确定了B-Z振荡反应中各组分的最佳浓度：丙二酸、硫酸、溴酸钾和硫酸铈铵浓度分别为0.45、3、0.25 mol/L和4×10-3mol/L[9]。反应温度对振荡反应的诱导期和振荡周期影响较大，而对振幅的影响较小。当温度较高时，振荡反应速率加快，所以诱导期时间大大缩短，振荡周期也明显减小。而当温度较低时，诱导期时间过长，振荡波形不稳定性，同时也不利于快速测定。本文中反应温度为37℃，此温度为人体的正常温度[9]。此外，搅拌对振荡参数也有一定的影响。当提高搅拌速率时，反应物和产物的扩散迅速，振荡周期和振幅也发生一定幅度的改变。另外，搅拌也影响氧及二氧化碳在振荡体系中的溶解度，溶解氧作为一种反应物可能也参与有关振荡反应[10]。本研究中搅拌速率为500 r/min，可以保证振荡波形的稳定。

2.2 没食子酸对B-Z振荡体系的影响

没食子酸对B-Z振荡体系的影响见图1。

图1 没食子酸对B-Z振荡体系的影响Fig.1 The influence of gallic acid on the B-Z oscillating system

本研究中参照紫外-可见分光度法测定茶多酚的方法，我们选用没食子酸作为标准品来绘制标准曲线[11]。从图1中可以看出，在B-Z反应的不同阶段加入等量的没食子酸水溶液，振荡体系的诱导时间、振荡周期和振幅都发生了改变。对于诱导时间，在诱导期处加入没食子酸时的诱导时间持续较长（162 s），而在波峰和波谷处时则稍短（157 s）。除此之外，随振荡反应的进行，诱导期处的最低振荡电位低于0.95 V，而波峰和波谷处则稍高于0.95 V。以上事实表明没食子酸可能与丙二酸一起作为有机底物参与了振荡反应，宏观上表现为振荡波形与波峰和波谷处时不同，这与文献中的报道是相符的[12]。比较波峰和波谷处加入没食子酸的振荡波形，二者振荡电位变化几乎相同。

另外，对比波峰和波谷处加入没食子酸的振荡波形，可以发现在波谷处时的波形比较稳定，适于测定茶多酚，为此选择在波谷处加入没食子酸来绘制标准曲线。

2.3 没食子酸标准曲线的建立

没食子酸的标准曲线见图2。可知，在第7个波谷处加入没食子酸，当其浓度在1.6×10-2g/L～4.5×10-2g/L范围内时，其浓度与振荡周期的改变量（ΔT）之间存在着良好的线性关系，即ΔT/s=328.3×[原花青素浓度]+3.1（R=0.999 0，n=9）。

图2 没食子酸的标准曲线Fig.2 The standard curve of gallic acid

为保证分析测定茶多酚具有较高的准确度和精密度，在保持各条件不变的情况下，连续重复了6组试验，其相对标准偏差（RSD）为1.4%，该数值＜5%，这表明试验的准确性和重现性良好（见表1）。没食子酸的检测限为1.37×10-9g/L。

表1 化学振荡法测定没食子酸含量Table 1 The measurement of gallic acid by chemical oscillation method

2.4 茶多酚的测定

为研究本试验所提出的方法的准确度，将提取的茶多酚溶液分别用紫外-可见分光光度法和化学振荡法进行了测定，结果如表2所示。

表2 紫外-可见分光光度法和化学振荡法测定结果的比较Table 2 The comparison of the results of UV Vis spectrophotometry and chemical oscillation method

从试验结果可知，B-Z振荡法的测定结果稍低于光度法，说明本研究所提出的方法可用于茶多酚的定量测定。

2.5 没食子酸（茶多酚）可能的扰动机理

图3（a）为没食子酸的分子结构，对于没食子酸的化学振荡研究，李和兴、高执棣等认为，在振荡过程中没食子酸既可作为有机底物，又可作为金属离子催化剂，从而构成所谓的非催化振荡体系[12-13]。因此，本研究中在经典的B-Z振荡体系中，另外加入没食子酸（茶多酚），必然对原来体系的振荡参数产生影响。

图3 没食子酸（GA）和EGCG的分子结构Fig.3 The molecular structure of gallic acid（GA）and EGCG

由图3可知，在B-Z振荡过程中加入没食子酸，体系的振荡周期和振幅都发生了改变[图3（b）]。我们认为茶多酚在振荡体系中可能发生以下3个过程：1）茶多酚是一种羟基酚类化合物，具有还原性，因此可与B-Z振荡体系中的氧化性成分（如BrO3-）发生氧化还原反应。此外，茶多酚中的酚羟基作为活泼氢的供体可使反应中产生的某些自由基失活，而本身被氧化形成稳定的醌类化合物。而这种醌类物质所起的作用与没食子酸类似，可用作B-Z振荡体系的反应底物和催化剂[13]。2）溴单质是B-Z振荡体系中的一种重要的中间产物，容易与亲电性的苯环发生取代反应，因此改变振荡反应的振荡周期。3）茶多酚中的邻位二羟基结构可与B-Z体系中作为催化剂的Ce4+离子发生配位作用，从而改变[Ce4+]/[Ce3+]的比值[9]。根据电极电位的Nernst方程，茶多酚加入后振幅对应的电位降低，但振荡波形基本不变，其可能发生的反应为：

3 结论

本文研究了没食子酸及茶多酚对B-Z振荡体系的影响，建立了一种检测茶多酚的新方法。与其他方法相比，该方法具有仪器设备简单、易于操作、灵敏度高和耗时少的特点。振荡机理的研究表明，茶多酚在酸性的条件下可与体系中存在的氧化性成分发生氧化作用，与Ce4+发生络合反应及与溴发生取代反应，因此改变了体系的振荡参数。以上茶多酚的振荡研究将有助于理解其作用机制和拓展其在食品、医药等领域的应用范围。

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