肝癌组织RPA1的表达变化及意义

张光林，王旭东，占红，蒋慧，陈曦

(黄石市中心医院，湖北黄石435000)

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤，为全球第5位常见肿瘤，占癌症死亡第2位［1］。目前发现肝癌为多蛋白、多基因参与、多步骤形成的疾病，但是其发病的具体分子机制仍不清楚。复制蛋白A(RPA)是真核细胞单链DNA(ssDNA)结合蛋白，在DNA代谢中RPA发挥重要作用，包括DNA复制、重组，以及 DNA损伤修复。RPA共由3个亚单位(RPA1、RPA2、RPA3)组成，每个亚单位都含有至少1个DNA结合结构域(DBD)。RPA1含有4个DBD结构域，分别称为 DBDA、DBDB、DBDC、DBDF。其中DBDA、DBDB的DNA结合活性最强［2］。研究证实，RPA在肿瘤组织中高表达，并且参与肿瘤的发生发展［3］。目前国内外尚未见有关原发性肝癌与RPA相关研究的临床报道。本文进行了相关探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择本院肝胆外科及肿瘤外科2013年8月～2014年2月进行手术治疗的肝癌患者30例，男22例、女8例，年龄42～62岁、中位年龄51岁。术中在无菌条件下留取癌组织以及距离癌边缘≥3 cm癌旁组织。用生理盐水冲洗后置入准备好的去RNA酶冻存管中，迅速将冻存管放入含冰块的保温桶内保存。标本于30 min内送入-80℃冰箱中冻存备用。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法检测RPA1 mRNA 利用总RNA提取试剂盒(北京TIANGEN公司提供)完成总RNA提取，并用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。应用软件Primer5.0设计引物，由上海生物化学公司合成cDNA，引物序列如下:RPA1:上游5＇-AAGTGGAGACCTACAACGAC-3＇;下游 5＇-ACAACCACCTGAGCGTAT-3＇;扩增产物为 312 bp。β-actin:上游5＇-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3＇;下游 5＇-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3＇;扩增产物为 285 bp。以cDNA为模板，RPA1、β-actin两种引物分别进行PCR反应;经凝胶成像仪成像，用Image J图像分析软件进行半定量分析。

1.2.2 Western blotting法检测RPA1蛋白 取100 mg组织，提取蛋白，按照BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所提供)说明测定蛋白的含量，采用SDS-PAGE电泳，进行转膜，封闭，一抗孵育;最后进行显色，取出条带晾干，照相。将胶片进行扫描或拍照，测定目的条带的灰度值。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据以±s表示，两组间比较采用t检验，两组以上比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌组织及其癌旁组织中的表达比较 见表1、图1、图2。

2.2 RPA1表达与肝癌临床病理参数的关系 见表2 和图3、4。

3 讨论

RPA在DNA延长和复制开始阶段起着重要作用［4］。近年研究发现，RPA不仅参与DNA复制，而且参与DNA的损伤修复。当细胞周期进程中出现异常事件，如DNA损伤或复制受阻时，细胞会很快启动DNA损伤修复调控体系，及时中断细胞周期的运行，以提供足够的时间修复损伤，保证细胞遗传的稳定性［5，6］。RPA 主要参与碱基切除修复、核苷酸切除修复、双链断裂修复和DNA错配修复。在核苷酸切除修复中，RPA 参与 DNA 损伤识别［7，8］，招募通用转录因子到达损伤部位。通用转录因子的两个亚基XPB和XPD打开损伤的DNA，XPA结合至损伤链，RPA结合至未损伤链以稳定该开放状态，然后由DNA切除修复交叉互补基因和DNA修复基因F形成的异二聚体切除损伤DNA的5＇端，DNA修复基因XPG切除3＇端，去除包含损伤部位的寡核苷酸片段，随后DNA聚合酶填充于该间隙，合成新的DNA，最后DNA连接酶补平缺口［9］。DNA双链断裂为最严重的损伤形式，RPA与双链断裂修复基因(Rad52、Rad51、Rad54)相互作用完成 DNA 修复，在此过程中，首先是 MRN复合物(Mre11/Rad50/Nbs1)切割双链断裂的DNA末端产生3＇末端。之后，Rad51与 RPA、Rad54、Rad52等结合在 DNA单链的3＇突出末端，促进链交换在同源DNA间进行，连接DNA链的断裂并修复可能的缺失。

表1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌组织及其癌旁组织中的表达(±s)

表1 RPA1 mRNA及蛋白在肝癌组织及其癌旁组织中的表达(±s)

注:与癌旁组织比较，*P＜0.05

组织 n RPA1 mRNA RPA1蛋白肝癌组织 30 0.635±0.228* 0.876±0.205*癌旁组织30 0.448±0.186 0.727±0.153

图1 RPA1 mRNA在肝癌组织及癌旁组织中的表达

图2 RPA1蛋白在肝癌组织及癌旁组织中的表达

表2 RPA1表达与肝癌临床病理参数的关系

图3 RPA1 mRNA在肝癌组织不同分期中的表达

图4 RPA1蛋白在肝癌组织不同分期中的表达

肝癌发展过程中肿瘤细胞的异常生长需要DNA的大量复制及充足的修复能力。我们假设认为，在肝癌DNA损伤修复过程中，由于RPA参与DNA的损伤修复，导致其表达上调，且随着肝癌的进展RPA的表达逐渐增多。本研究结果显示，RPA1在30例肝癌组织中的表达与癌旁组织相比上调，与国内外有关实验结果均一致，提示RPA1有可能参与了肝癌的形成。本研究结果还显示，RPA1的表达上调与肝癌患者性别、年龄、乙肝感染、病理分级、淋巴结转移、门脉癌栓等无关，与肝癌患者的TNM分期呈正相关，进一步证明了RPA可能参与了肿瘤的发生发展过程。但与国内外有关研究有一定的差异，Levidou等［10］报道RPA1和RPA2在膀胱癌中高表达，但是随着肿瘤的临床分期升高其表达反而下降，其中RPA2对肿瘤的早期发展意义明显，他们推断RPA2可能与细胞周期蛋白D1协同推动早期膀胱癌的形成。原发性肝癌的发生是以多个抑癌基因失活和原癌基因激活为基础的多阶段多步骤过程。抑癌基因p53的突变失活将促进肝癌的发生，是肝细胞生物学特性发生改变的重要分子事件。近年相关研究证实，RPA(特别是RPA2)与p53基因相互作用，从而抑制野生型p53的活性，使受损的DNA在细胞周期检查点得到修复［11］。Givalos等［12］运用免疫组化法检测了RPA1、RPA2在130例结肠癌中的表达，结果显示RPA1、RPA2与患者的临床分期、淋巴结转移有关，在Ⅱ、Ⅲ期结肠癌组织中RPA1、RPA2表达越高的患者，生存时间越短;且RPA2的表达与肿瘤组织分级相关，他们推测正是RPA的过度表达抑制了p53抑癌基因的活性，从而使肿瘤更容易形成。Dahai等［13］检测 RPA1和RPA2在食管癌组织中的表达情况，结果显示RPA1和RPA2在食管癌组织中的表达随着临床分期、组织分级的升高而升高，且RPA1表达越高的患者生存率越低。因此他们得出结论RPA可以作为预测食管癌恶性程度及临床进展的重要指标。

综上所述，RPA表达的增多可能与肿瘤的生长有密切关系。但是RPA在不同肿瘤中的不同阶段作用可能存在差异，在不同肿瘤中RPA可能与不同的DNA修复基因相互作用，从而对肿瘤的发生发展起到作用。在本实验中由于条件所限只研究了RPA1在肝癌中的半定量表达，RPA1与RPA2在肝癌形成中发挥着怎样的不同作用，有什么共同联系，需要进一步实验研究。由上述基础及临床试验可知RPA在DNA复制及修复中有重要作用，有望成为肿瘤治疗的重要靶点

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