宫颈癌中长链非编码RNA CRNDE表达及其临床意义

韩懿 劳美琼 雷巧如 李艳娜

长链非编码RNA（long non coding RNA，LncRNA）是一类不编码蛋白、转录本长度超过200 nt的非编码RNA分子。近年来发现LncRNA与X染色体沉默、染色体修饰、转录激活与抑制、RNA剪切等有关，在胚胎与组织发育、细胞分化、神经代谢性疾病、肿瘤等中发挥重要功能［1-3］。越来越多的证据显示LncRNA在肿瘤的发生发展中起着重要作用，是肿瘤诊断和治疗新的研究前沿［4-5］。研究发现，LncRNA CRNDE（colon rectal neoplasia differentially expressed）在结直肠癌、胶质瘤等多种肿瘤中表达明显升高，提示其与肿瘤的发生发展密切相关，但其生理功能和作用机制尚不明确［6-7］。关于LncRNA CRNDE在宫颈癌中的功能研究，目前国内外相关报道较少。本研究通过比较LncRNA CRNDE在宫颈癌组织及癌旁组织中表达，分析其与患者临床预后的关系，为LncRNA CRNDE用于宫颈癌诊断、治疗及预后评估提供理论依据，为寻找新的宫颈癌肿瘤标志物提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 收集2009年10月至2014年10月87例广东省开平市中心医院行手术切除的宫颈癌患者的癌组织与对应的癌旁组织标本，所有标本均经病理学检查确诊为宫颈癌，标本获取前全部病例均未行化疗和放疗，临床资料完整。87例宫颈癌患者的年龄为24～60岁，中位年龄为40岁；年龄＜40岁患者为44例，年龄≥40岁为43例；Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期20例；鳞癌68例，腺癌19例；无淋巴结转移35例，淋巴结转移52例。65例患者接受了手术，60例患者接受了放化疗。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 随访 全部患者出院后均进行随访，方式为电话和门诊随访，内容包括一般情况、临床症状和影像学检查。随访起点为病理确诊日期，末次随访时间为2015年3月31日，截止随访终止患者生存41例、死亡46例，无失访病例。

1.2 方法

1.2.1 试剂 Trizol试剂盒、AMV逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、LncRNA CRNDE引物均购自中国上海Invitrigeng公司。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法 收集宫颈癌组织及癌旁组织（50～100 mg）标本，放入液氮冷冻后，铝箔包裹，在研钵中充分研磨，用Trizol试剂反复洗涤研磨后的碎末，经焦碳酸二乙酯（DEPC）水处理后冻存管收集，放入液氮中，提取RNA进行检测。在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨（样品总体积不超过所用Trizol体积10%），移入去RNA酶的EP管中，提取总RNA。取上述准备的RNA，逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明，在20 μL体系中加2 μg总RNA进行cDNA合成。采用LncRNA CRNDE基因特异性引物CRNDE-FW2及CRNDE-RV2进行RT-PCR，以GAPDH作为内参照。LncRNA CRNDE上游引物为5'-GCGGAG GTTAAGTGT-3'，下游引物为5'-AACAGGTTTACCTCCT TATCTTCAGAA-3'；内参照GAPDH上游引物为5'-GGA AGGACTCATGACCACAGTCC-3'，下游引物为5'-TCGC TGTI'GAAGTCAGAGGAGACC-3'。比较宫颈癌组织与癌旁组织中LncRNA CRNDE基因表达的变化。实验重复3次。LncRNA CRNDE相对表达量（RQ）=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt样品-ΔCt对照=（Ct样品LncRNA CRNDECt样品GAPDH）-（Ct对照LncRNA CRNDE-Ct对照GAPDH）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。宫颈癌组织与癌旁组织中LncRNA CRNDE差异表达采用t检验；LncRNA CRNDE表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系采用χ2检验。LncRNA CRNDE表达与患者生存期关系采用Kaplan-Meier法，采用Cox比例风险模型用于宫颈癌预后的多因素分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA CRNDE在宫颈癌组织中表达及其与患者的预后关系

RT-PCR检测LncRNA CRNED在87例宫颈癌组织和癌旁组织中表达，结果提示LncRNA CRNED在宫颈癌组织中表达为3.974±0.981，明显高于癌旁组织1.237±0.325，差异具有统计学意义（P＜0.01，图1）。

LncRNA CRNED表达与患者年龄、肿瘤大小、病理类型、肿瘤分化、FIGO分期、淋巴结转移和肿瘤浸润深度等临床病理特征的关系见表1。LncRNA CRNED表达与患者的FIGO分期、淋巴结转移和肿瘤浸润深度相关，差异具有统计学意义（P＜0.05），而与患者的年龄、肿瘤大小、组织来源和分化程度无关（P＞0.05）。2-ΔΔCt≤1定义为低表达，2-ΔΔCt＞1为高表达［8］。

图1 LncRNA CRNDE在宫颈癌及癌旁组织中表达Figure1 Expression of LncRNA CRNDE in cervical cancer and paraneo⁃plastic tissue

表1 LncRNA CRNDE表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

表1 LncRNA CRNDE表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 （续表1）Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

2.2 LncRNA CRNDE表达对患者生存期的影响

采用Kaplan-Meier法分析LncRNA CRNDE表达与患者生存期关系，结果发现LncRNA CRNDE高表达患者的生存时间较低表达者明显缩短，差异具有统计学意义（χ2=16.185，P＜0.001，图2）。

图2 LncRNA CRNDE表达水平与患者生存期关系Figure 2 Correlation between Kaplan-Meier survival curves and Ln⁃cRNA CRNDE level

Cox回归多因素分析发现FIGO临床分期、淋巴结转移和肿瘤侵润深度及LncRNA CRNDE表达可作为宫颈癌患者独立的预后因子（表2）。

表2 Cox多因素分析患者的临床病理特征与预后的关系Table 2 Cox multivariate analysis for correlation between clinicopatho⁃logical features and prognosis in patients

3 讨论

宫颈癌是全世界妇女中发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤，也是最常见的生殖道恶性肿瘤，严重威胁女性健康。近40年来其发病率却及死亡率已有明显下降，但年轻女性宫颈癌的发病率却有明显上升趋势，已引起国内外学者的关注。虽然多数的早期宫颈癌可经手术或放疗等手段而治愈，但其中20%～25%病例却因复发和远处转移而导致治疗失败，因此宫颈癌的预后也是不容忽视的问题［9-10］。LncRNA是一类不编码蛋白、转录本长度超过200 nt的长链非编码RNA分子，可在多层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达，其功能目前尚不完全清楚［11］。近年来的研究表明，LncRNA以RNA形式在表观遗传、转录和转录后水平调控基因的表达，广泛参与调控个体的生长发育以及细胞凋亡、增殖、分化等生命活动，并且还参与了人类癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等病理进程，LncRNA的研究已成为现代分子生物学领域研究的重要热点［5，12-13］。2011年发现的LncRNA CRNDE是结直肠肿瘤差别表达基因，在结直肠癌以及多种肿瘤组织中表达上调［14］，其转录产物只有较低的编码蛋白能力，因此将其归为长链非编码RNA。LncRNA CRNDE定位于16号染色体IRX5基因的反义链上，与其共用一个双向启动子。LncRNA CRNDE基因全长约10 kb，包含5个核心外显子和1个出现频率较低的附加外显子［15］。该基因存在着多种可变剪接，至少存在十几种转录本，其中一些转录本中存在不同的内含子序列。目前研究发现，LncRNA CRNDE在许多癌组织或细胞（实体肿瘤及白血病）中表达明显升高，其中在胶质瘤中LncRNA CRNDE上调14～32倍［16］。本研究发现LncRNA CRNED在宫颈癌组织中表达明显高于癌旁组织，与LncRNA CRNED在结直肠癌和脑胶质瘤中表达的结果一致［6，14］。此外，本研究还发现，LncRNACRNED表达与患者的FIGO分期、淋巴结转移和肿瘤侵润深度相关，LncRNA CRNDE高表达患者的生存期较低表达者明显缩短，Cox多因素分析发现LncRNA CRNDE表达可作为宫颈癌患者独立的预后因子。

总之，本研究将为LncRNA CRNDE应用于宫颈癌的诊断、治疗及预后提供理论依据，为寻找宫颈癌肿瘤新的标志物提供思路。

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