FAT10通过激活RhoA介导肝细胞性肝癌侵袭 转移*

胡威 董忠谊 吴德华

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上最常见的恶性肿瘤之一，在我国HCC发病人数约占全球的55%，在肿瘤相关死亡中高居第2位［1］。研究表明：影响HCC患者生存最主要的因素为术后复发及远处转移［2］。因此寻找肝癌复发、转移相关的风险因素及探讨其促癌机制将有助于临床诊疗策略的制定及抗肿瘤新药的开发。近年研究发现泛素样蛋白家族成员FAT10参与恶性肿瘤的发生、发展［3-5］，本课题组前期的研究也证实FAT10在乙肝相关肝癌中高表达，且促进肝癌细胞的侵袭、转移［6］。Rho家族成员RhoA可直接影响细胞骨架蛋白（F-actin）重构，改变细胞的迁移、侵袭能力［7-8］，是否FAT10促进肝癌细胞侵袭、转移通过RhoA介导尚不明确。本研究拟初步探讨FAT10对细胞骨架蛋白F-actin的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料

病例样本来自于2003年3月至2006年10月南方医科大学南方医院行手术切除并经病理证实为原发性肝细胞癌患者108例（表1）。按照美国肿瘤联合会（AJCC）2003年联合制定的TNM分期法进行临床分期，所有患者术前均未接受其他治疗手段，术后肿瘤转移及复发的诊断主要依据影像学和临床病理活检证实。

1.2 方法

1.2.1 组织标本免疫组织化学检测 将肝癌标本组织切片置于65℃烤箱中烘烤2 h，二甲苯常规脱蜡，梯度乙醇水化后，PBS冲洗3次（5 min/次），再于3%H2O2室温孵育10 min去除内源性过氧化物酶的影响；PBS冲洗3次（5 min/次），将组织切片完全浸泡在PH值为6.0的枸橼酸酸溶液中，高压修复3 min，室温冷却；PBS冲洗3次（5 min/次），其后分别滴加FAT10（美国Epitomics公司，1∶100）及active-RhoA（美国AB⁃cam公司，1∶100）一抗工作液，4℃过夜；复温40 min防脱片，PBS冲洗3次（5 min/次），滴加二抗工作液（丹麦Dako公司），室温孵育1.5 h；DAB（丹麦Dako公司）显色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察，评分及采图。

1.2.2 免疫组织化学结果判定 由两位高年资病理医师分别对染色结果进行评判，每个点随机选取10个高倍视野（×400），每野计数500～1 000个细胞。从两方面进行计分，一方面据染色强度：无着色0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；另一方面据阳性细胞数计分：1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，76%及以上为4分。两项评分相乘为最终结果：3分以下为阴性（-），3分为弱阳性（+），4分为中阳性（++），5分及以上为强阳性（+++）［8］。

1.2.3 细胞培养 本实验4株肝癌细胞株7721、HepG2、Huh7及LM3均来源于南方医科大学肝病研究中心。7721细胞株培养于含10%胎牛血清的RP⁃MI 1640培养液中，其余细胞株均培养于DMEM高糖培养基中（试剂及血清均来自于美国gibco公司），置于37℃、5%CO2的相对饱和的培养箱中（美国Thermo公司）传代培养，实验细胞均处于对数生长期。

1.2.4 质粒及siRNA转染

1.2.4.1 质粒转染 肝癌细胞接种于含10%胎牛的培养基中，置于37℃，含5%CO2饱和培养箱中培育。选取对数生长期细胞，制备密度为1×106/mL的单细胞悬液，接种于6孔培养板中，培养24 h后细胞长至80%融合时进行转染，按照Lipo2000试剂盒说明操作转染FAT10过表达及对照质粒，6 h后更换新鲜含胎牛血清的培养基（实验前均经转染后48 h Western blot验证转染效率）。

1.2.4.2 siRNA转染 siRNA干扰 FAT10（NM_006398）基因表达，干扰序列为：sense 5'-GAGACUA AGACGGGUAUAATT-3'，antisense 5'-UUAUACCCG UCUUAGUCUCTT-3'（上海吉玛基因公司），严格按试剂盒说明书用脂质体RNA-iMAX转染肝癌细胞（In⁃vitrogen），肝癌细胞于转染前12 h被铺于6孔板，50 pmolsiRNA或对照序列及5 μL的脂质体RNAiMAX被混合于Opti-MEM培养基中，室温孵育20 min，加入6孔板中培养48h备用（实验前均经转染后48 h Western blot验证干扰效率）。

1.2.5 Western blot分析 用RIPA试剂裂解（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂）以上4株细胞，BCA法测定蛋白质浓度。将等量（30μg）蛋白质的全细胞裂解液经SDS-PAGE凝胶电泳后，将分离出的蛋白电转到PVDF膜上。印迹膜在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液内室温封闭1 h各自加入兔抗人FAT10（美国AB⁃cam公司，1∶5 000稀释）、total RhoA（美国ABcam公司，1：500稀释）及active-RhoA（美国ABcam公司，1∶500稀释），ROCK（美国ABcam公司，1：10 000稀释）βactin单克隆抗体（美国ABcam公司，1∶7 500稀释，作为内参），4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，15 min/次，滴加HRP标记的抗兔二抗（美国ABcam公司，1∶15 000稀释），室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法检测（美国Thermo公司）。实验重复3次。

1.2.6 免疫荧光 细胞爬片于4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次（5 min/次），0.25%Trixton通透5 min，PBS漂洗3次（5 min/次），5%BSA封闭50 min，F-action一抗（美国ABcam公司，1∶50），4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，5 min/次，羊抗兔单克隆荧光二抗（江苏碧云天生物技术公司，1∶100）孵育1.5 h，正置荧光显微镜观察F-actin变化并采图。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行数据处理。RhoA及FAT10与患者临床特征间的相关性，及二者间的相关性采用χ2检验，不同分组资料的生存分析采用K-M生存分析法进行，P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 active-RhoA及FAT10同HCC患者转移及复发密切相关

免疫组织化学结果显示active-RhoA蛋白表达水平同HCC转移（P=0.036）及复发（P=0.026）密切相关，FAT10蛋白表达亦同HCC转移（P=0.031）及复发（P=0.004）密切相关（表1）；FAT10高表达者预后明显差于低表达者（P=0.026），active-RhoA高表达患者预后亦明显差于低表达者（P=0.019，图1）。

2.2 FAT10与active-RhoA相关性

免疫组织化学结果显示FAT10同active-RhoA表达水平呈明显的正相关（P＜0.001，表2）；且active-Ro⁃hA与FAT10存在共定位（图2）。

2.3 FAT10促进活化型RhoA的表达

在FAT10过表达细胞株7721及HepG2中，active-RhoA及ROCK蛋白表达水平明显高于对照组（图3）；在FAT10干扰的细胞株Huh7、LM3中active-RhoA及ROCK蛋白表达水平明显低于对照组（均P＜0.01）。

2.4 7721细胞过表达FAT10后细胞骨架蛋白FAT10的变化

对照组肝癌细胞株7721 F-actin表达较弱，细胞膜染色不连续，胞质中蛋白表达呈云絮状，过表达FAT10后细胞浆内F-actin荧光表达较弱，膜荧光表达明显增强，形态连续均匀（图4）。

表1 108例肝癌患者临床资料和active-RhoA及FAT10表达相关性分析Table 1 Clinical characteristics of 108 HCC patients and their correlation with active-RhoA and FAT protein expression level

图1 108例来自于不同active-RohA和FAT10分组HCC患者的生存分析Figure 1 Survival analysis of 108 HCC patients from different active-RhoA and FAT10 groups

表2 FAT10同active-RhoA间相关性分析Table 2 Correlation between FAT10 and active-RhoA

图2 FAT10与active-RhoA的免疫组化共定位（IHC×400）Figure 2 Co-location of FAT10 and active-RhoA by IHC（IHC×400）

图3 Western blot检测不同HCC细胞株过表达/干扰FAT10后RhoA/ROCK蛋白水平的变化（n=3）Figure 3 Western blot showed changes in RhoA and ROCK in different HCC cells after overexpression or interference of FAT10(n=3)

图4 采用免疫荧光检测过表达FAT10的7721细胞骨架蛋白F-actin（×400）Figure 4 F-actin of 7721 cells detected by immunofluoresence after FAT10 overexpression（×400）

3 讨论

FAT10位于人Ⅰ类主要组织相容性复合体染色体位点中，属泛素样蛋白家族［5］，目前鉴定的泛素样家族成员主要有：NEDD8、SUMO、ISG15、ATG8、ATG12和URM1，这一家族蛋白参与细胞分化、DNA损伤修复、自噬、信号转导、胚胎发育等多种重要的细胞生命活动，无疑FAT10紊乱会导致恶性肿瘤的发生及发展。目前已证实，FAT10在直肠癌、胃癌和妇科肿瘤中明显高表达［9-13］，在肝癌中的高表达率甚至达90%［14］；对药物诱导性肝癌的研究表明FAT10参与肝脏癌前病变及肿瘤的形成［15-16］；分子机制探讨则表明：FAT10是p53重要的下游靶基因，在p53缺陷细胞中FAT10的异常表达可能直接导致肿瘤发生，而且FAT10还可在有丝分裂期间非共价结合许多肿瘤中共有的纺锤体检测点蛋白MAD2，导致染色体稳定性下降，致恶性肿瘤发生及发展［17］；本研究及南昌大学 邵 江 华等阐明：FAT10 可通过 Akt/GSK3β/βcatenin通路或直接作用于β-catenin促进肝癌的侵袭及转移［8，18］。本研究证实：FAT10同HCC患者侵袭、转移密切相关，且FAT10高表达患者预后明显差于FAT10低表达患者，进一步明确了FAT10在肝癌侵袭、转移中的作用，也为其在肝癌预后预测及评估中的价值提供了新的依据。

RhoA属于小G蛋白Rho家族的重要成员，在细胞骨架蛋白（F-actin）重构的调控中具有重要作用，参与细胞形态结构变化、黏附及迁移运动等多种生物学过程［3-4］。多种恶性肿瘤如肺癌、结肠癌、乳腺癌中存在RhoA的高表达［18］，且其表达水平与乳腺癌的组织病理分级和淋巴转移呈正相关，可作为乳腺癌重要的预后预测指标［19］；静息时，RhoA位于细胞质，肿瘤细胞受外因刺激时，RhoA被激活并转位至细胞膜，活化的RhoA作用于下游效应蛋白Rho相关激酶（Rho associated kinase，ROCK）或inDia，进而调节细胞骨架重构，促肿瘤发生侵袭和转移［20］，乳腺癌研究证实靶向RhoA的miRNA-133可抑制RhoA蛋白的表达并抑制癌细胞的侵袭及转移［21］。上述研究均提示了RhoA在肿瘤侵袭、转移中的重要作用，但是否FAT10促进肝癌侵袭、转移由RhoA介导，尚不明确，本研究结果显示：active-RhoA高表达患者预后明显差于低表达者；且FAT10的表达同active-RhoA密切相关，二者存在一致的共定位。Western blot检测的结果亦表明：过表达FAT10促进肝癌细胞株active-RhoA及其下游细胞骨架调控分子Rock的表达，干扰FAT10则抑制活化型RhoA及ROCK蛋白的表达。这提示FAT10影响肝癌细胞的侵袭、转移可能通过其作用于RhoA并活化RhoA-ROCK通路介导F-actin是细胞骨架结构的物质基础，在细胞侵袭迁移中起着重要的支架作用［4］。既往研究均缺乏FAT10作用于F-actin的直接证据，本研究免疫荧光的结果显示：过表达FAT10促进肝癌细胞株7721 F-actin的表达，并且使F-actin连续表达于肝癌细胞膜，这为FAT10促进肝癌细胞的侵袭、迁移提供了物质可能。

综合本课题组已发表的数据及上述试验结果，FAT10可作为HCC预后预测较有潜力的指标；且FAT10影响HCC侵袭、转移可能通过增加活化型RhoA，及其下游效应蛋白ROCK的表达，进而促进细胞骨架蛋白F-actin的表达和分布来实现。另外，本课题组及其他学者研究证实FAT10可直接作用于βcatenin介导肝癌细胞的侵袭及转移，且有报道认为β-catenin对RhoA-ROCK通路亦存在一定的调控作用［22-23］，因此推测FAT促肝癌细胞侵袭转移的作用可能通过直接作用于β-catenin进而活化RhoA-ROCK通路，但目前缺乏直接的证据，有待进一步研究。

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