中药制剂联合美沙拉嗪对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用

余贻汉，杨建美，赵 莉，徐 沙，汪 毅

中药制剂联合美沙拉嗪对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用

余贻汉，杨建美，赵 莉，徐 沙，汪 毅*

目的 探讨中药制剂联合美沙拉嗪对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用。方法 以C57BL/6小鼠为研究对象，采用DSS饮水法建立结肠炎模型，随机分为4组：模型组、中药制剂组、美沙拉嗪组、美沙拉嗪+中药制剂组，分别于第4天给予生理盐水、中药制剂、美沙拉嗪、美沙拉嗪联合中药制剂灌胃。每日观察各组小鼠精神状态、大便性状及体重变化；于第10天收集小鼠粪便行隐血测定，计算疾病活动指数(DAI)；断颈处死各组小鼠，取结肠炎病变严重部位测定髓过氧化物酶活力(MPO)；取结肠炎病变严重部位做病理切片，行HE染色评价病变严重程度。结果 成功建立小鼠结肠炎模型，各治疗组的DAI、MPO和组织学评分均较模型组明显改善，其中联合治疗组较美沙拉嗪组明显改善，差异有统计学意义。结论 复方中药制剂联合美沙拉嗪治疗不仅能改善DSS诱导的小鼠结肠炎的症状评分，也能改善其病理评分。

中药制剂；美沙拉嗪；结肠炎；DSS

0 引言

溃疡性结肠炎(Ulcer colitis，UC)是一种肠道的非特异性炎症性疾病，以反复发作的粘液脓血便为主要临床表现。近年来，我国UC的发病率逐年上升[1]。目前对其发病机制的研究主要集中在感染因素、遗传因素、环境因素及自身免疫因素4个方面[2]，但其具体发病机制尚不完全清楚。随着医学的发展，目前应用于溃疡性结肠炎的治疗药物主要有：氨基水杨酸类、激素类、免疫抑制剂、生物制剂及中药类[3]。Meta分析结果显示，美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎在有效率、缓解率方面均优于安慰剂组[4]，但其治疗周期长、停药易复发、价格昂贵，患者难以长期坚持使用。近年研究表明，美沙拉嗪联合中药治疗UC的疗效较好[5-6]。本研究旨在研究美沙拉嗪(美沙拉嗪缓释颗粒剂)联合中药制剂对小鼠UC模型的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂 中药制剂的组方包括：黄连5 g，白头翁15 g，石榴皮15 g，五倍子10 g，总量45 g，置于1 000 mL烧杯中，加适量纯化水浸泡30 min，煮沸后微沸30 min，滤出头煎药渣加适量水煮沸后微沸30 min，滤出二煎，合并两次煎液静置沉淀后加热浓缩至100 mL，中药药液浓度为含生药0.45 g/mL，药原液装瓶，高压消毒后密封保存备用，中药制剂灌胃剂量为0.2 mL/10 g体重，相当于9 mg/g体重。葡聚糖硫酸钠(Dextran sulphate sodium，DSS，美国Sigma公司)，美沙拉嗪(法国爱的发制药集团，批号：H20100063)，髓过氧化物酶试剂盒(购自南京建成科技有限公司)。

1.2 实验对象及模型建立 C57BL/6小鼠40只，购自武汉大学实验动物中心[许可证号：SCXK(鄂)2008-0004]，6～8周龄，18～22 g，雌雄不限，饲养于华中科技大学实验动物中心[许可证号：SYXK(鄂)2010-0057]，适应性喂养至少7 d。将小鼠随机分为4组：模型组、中药制剂组(中药组)、美沙拉嗪组及美沙拉嗪+中药制剂组(联合组)，每组10只。参照文献[7]制备小鼠结肠炎模型：给予所有小鼠含3%(w/v)DSS饮水10 d。

1.3 处理方法 自造模后第3天开始给予干预因素：中药组给予中药制剂0.2 mL/10 g体重灌胃；美沙拉嗪组给予美沙拉嗪7.4 mg/(kg·d)灌胃[8]；联合组给予同剂量的美沙拉嗪和中药制剂灌胃；模型组给予同剂量的生理盐水灌胃。

1.4 观察内容

1.4.1 疾病活动指数 每日观察小鼠精神状态，大便性状及体重变化。于第10天记录小鼠大便性状，收集小鼠粪便行隐血测定，称重计算小鼠体重变化百分数，按表1计算所有疾病活动指数(Disease activity index，DAI)。DAI=(体重下降指数+大便性状指数+便血指数)÷3。

1.4.2 髓过氧化物酶活力 10 d后断颈处死所有小鼠，剖取结肠组织，冲洗干净后，称取0.2 mg充分研磨后按说明书测定小鼠结肠髓过氧化物酶(MPO)活力。

表1 DAI评分

1.4.3 组织学评分 断颈处死小鼠后，剖取结肠组织，取病变严重处用生理盐水冲洗干净，10%甲醛固定24 h后脱水、石蜡包埋，5 μm连续切片，苏木素-伊红染色。在显微镜下观察，参照文献[9]并稍做改动，制定组织学评分标准：①炎症：无：0分，轻度：1分，中度：2度，重度：3分；②杯状细胞：未见消失：0分，消失：1分；③病变深度：无：0分，粘膜下层：1分，肌层：2分，浆膜层：3分；④溃疡：无：0分，糜烂：1分，溃疡：2分；⑤隐窝脓肿：无：0分，有：1分。

2 结果

2.1 造模后DAI比较 小鼠在造模后第3～4天开始出现懒动、稀便、粘液血便，伴有体重下降。美沙拉嗪和联合组小鼠的症状明显改善，体重改变较小，联合组的症状改善更明显。于第10天计算4组小鼠的DAI，模型组小鼠的DAI高于其他3个治疗组(P=0.00)。联合组的DAI较美沙拉嗪治疗组降低(P<0.01)。见表2。

2.2 各组髓过氧化物酶(MPO)活力比较 3个治疗组的MPO活力均较模型组明显改善(P=0.00)，联合组比美沙拉嗪组改善更明显(P<0.01)，差异有统计学意义，见表2。

2.3 组织学评分 结肠炎模型小鼠肠粘膜连续性消失，有大量炎性细胞浸润，杯状细胞消失，隐窝脓肿及溃疡形成。治疗组小鼠肠粘膜炎症较轻，少量炎细胞浸润，没有明显的隐窝脓肿(见图1)。模型组小鼠的组织学评分为7.21±1.23，3个治疗组评分较模型组均有所改善(F=19.75，P=0.00)。联合组的组织学评分较美沙拉嗪组明显减低(P<0.01)，差异有统计学意义，见表2。

表2 各组DAI、MPO、组织学评分对比

注：与模型组比较，*P<0.01；与美沙拉嗪组比较，#P<0.01

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种非特异性炎症性疾病，西医药物治疗的目的主要是诱导并维持缓解，但粘液血便反复发作使得该病的治疗效果较差[10]。美沙拉嗪是治疗溃疡性结肠炎的经典药物，其疗效确切，不良反应少，服用方便[11-13]。但由于药物依赖性、长期服用的耐药性与不良反应及对患者的经济压力，限制了其在临床的广泛使用。

图1 小鼠结肠HE染色(×200)

中医学将溃疡性结肠炎归属于“泄泻”、“痢疾”、“肠癖”等范畴，定为湿热内蕴型、气滞血瘀型、脾胃虚弱型和阴血亏虚型4型，其治疗多选择清热解毒、凉血止痢、活血化瘀、行气止痛等组方，可口服，亦可保留灌肠[14]。本研究的中药组方包括黄连、白头翁、石榴皮、五倍子等。其中，黄连和白头翁为千古名方“白头翁汤”之君药，为治泄痢之要药和良药。胡屹屹等[15-16]研究发现，白头翁汤能明显抑制LPS诱导内皮细胞分泌多种炎性因子，抑制凋亡基因转录，增强细胞能量代谢。方中黄连对革兰阳性和阴性细菌、原虫及各型流感病毒、真菌类等均有一定的抑制作用[17]。胡淑平等[18]研究发现，黄连素能显著抑制小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-6及COX-2蛋白、mRNA的表达，减轻炎症反应。石榴皮和五倍子酸涩收敛，入大肠经，能涩肠止泄痢，为治疗久泻久痢之常用药，故该组方可以显著改善结肠炎症状。

本研究结果表明，中药制剂联合美沙拉嗪能够明显改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的临床症状，减轻结肠组织的充血出血、水肿、溃疡和炎症反应，推测与复方中药抗炎、抑制炎症反应及广谱抗菌药物等有关，提示复方中药制剂联合美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎可通过不同的机制来减轻病情，效果优于单用美沙拉嗪治疗。

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Therapeutic effect of traditional Chinese medicine combined with mesalazine on DSS-induced colitis in mice

YU Yi-han,YANG Jian-mei,ZHAO Li,XU Sha,WANG Yi*

(Department of Digestive Internal Medicine,Hubei Xinhua Hospital,Wuhan 430015,China)

Objective To investigate the therapeutic effect of traditional Chinese medicine(TCM)combined with mesalazine on DSS-induced colitis in mice.Methods C57BL/6 mice were used as research subjects and were given water containing dextran sulfate sodium(DSS)to establish the model of colitis.They were randomly divided into four groups,mice in model group,TCM group,mesalazine group,TCM combined mesalazine group(combined group)were given normal saline,TCM,mesalazine,TCM combined with mesalazine by gavage administration from the fourth day respectively.The mental state,defecate traits and changes of body weight were observed every day.The disease activity index(DAI) was calculated.All the mice were sacrificed on the 10th day,and the inflammation degree of colon was assessed by HE dyeing as well as myeloperoxidase(MPO)activity assay.Results Colitis models of mice were established successfully.Compared with model group,DAI,MPO activity,microscopic inflammation score in treatment groups were improved significantly,and the levels in combined group were lower than those of mesalazine group.Conclusion The combined treatment of traditional Chinese medicine and mesalazine can improve not only the symptom score,but also the microscopic inflammation score in colitis mice induced by DSS.

Traditional Chinese medicine;Mesalazine;Colitis;Dextran sulfate sodium

2014-12-09

湖北省新华医院消化内科，武汉 430015

湖北省卫生厅资助项目(XF2012-30)

10.14053/j.cnki.ppcr.201506002

*通信作者