雷公藤内酯醇对糖尿病肾病大鼠肾内Glut-1、Glut-4表达的影响

尤丽菊，郭 辉，李宜川

雷公藤内酯醇对糖尿病肾病大鼠肾内Glut-1、Glut-4表达的影响

尤丽菊，郭 辉，李宜川

目的 探讨雷公藤内酯醇对糖尿病肾病大鼠肾内Glut-1、Glut-4表达的影响。方法 将45只大鼠按体重随机分为正常对照组(C组，13只)和糖尿病模型组(32只)。模型组腹腔注射链脲菌素(STZ) 52 mg/kg，1次/d，连续5 d；正常对照组仅腹腔注射等体积上述缓冲液。完成STZ 注射72 h后，尾静脉采血测空腹血糖，并同时测尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者列入糖尿病观察对象。将造模成功的28只雄性大鼠，按体重、空腹血糖随机分为DM模型组对照(DM组，14只)、雷公藤内酯醇组(TP组，14只)。结果 DM组、TP组第4、第8周的24 h尿mALB定量较C组明显增加(P<0.01)，且DM组第8周高于第4周(P<0.01)，TP组第8周较第4周明显降低(P<0.01)。DM组系膜细胞及上皮细胞Glut-1的表达较正常对照组均明显增加(P<0.05)，Glut-4的表达均有所减少(P<0.05)。与DM组比较，TP组系膜细胞及上皮细胞Glut-1的表达降低(P<0.01)；Glut-4在系膜细胞的表达升高(P<0.05)，在上皮细胞的表达变化不明显(P>0.05)。结论 雷公藤内酯醇能明显降低糖尿病肾病大鼠肾小球系膜细胞及上皮细胞内的Glut-1含量，增高Glut-4在肾小球系膜细胞的表达。

雷公藤内酯醇；糖尿病肾病；大鼠；Glut-1；Glut-4

0 引言

雷公藤内酯醇(Triptolide，TP)又名雷公藤甲素，是从卫矛科植物雷公藤(TripterygiumWilfordiiHook.f)中分离提取得到的环氧化二萜内酯化合物，难溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿等，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种生物学活性[1]，早已用于糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)的治疗[2]。测定24 h尿微量白蛋白(mALB)是公认的诊断糖尿病(Diabetes mellitus，DM)早期肾病的标准方法[3]。葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter，Glut)是调控细胞内糖摄入及糖代谢的第一道关卡，在介导糖尿病组织损伤中起重要作用[4]。其中葡萄糖转运蛋白-1(Glut-1)是哺乳动物细胞糖跨膜转运的主要载体，能促进葡萄糖向细胞内扩散及代谢[5]。Glut-1在肾小球系膜细胞和肾小球上皮细胞的表达已经得到了确认[6-7]。Glut-4主要分布于脂肪细胞和肌肉细胞[8]，即胰岛素敏感性细胞，这些细胞在胰岛素刺激下葡萄糖摄入迅速升高，Glut-4在肾血管、肾小球与肾小管也有表达[9-10]。本实验主要观察TP对糖尿病肾病大鼠肾内Glut-1、Glut-4表达的影响，为TP对糖尿病肾病的预防、治疗提供实验依据。

1 主要仪器和试剂

激光共聚焦显微镜(Bio-Rad Radinace 2100)、图像分析仪(Media Cybernetics公司)、快速恒温冰冻切片机(YD1508浙江金华益迪医疗设备厂)、血糖仪(罗氏公司)、全自动生化分析仪(日立7600型)、尿mALB试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)、链脲佐菌素(Streptozocin，STZ，Sigma公司)、TP(上海融合有限公司)，Glut-1、Glut-4多克隆抗体，即用型SABC试剂盒，FITC标记二抗等(武汉博士德生物工程公司)。

2 实验方法

2.1 实验动物与分组 SD大鼠45只，体重160～180 g，雄性，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(鄂)2011-0007。将45只雄性大鼠按体重随机分为正常对照组(C组，13只)和糖尿病模型组(32只)。造模前正常饲养1周，然后禁食12 h。糖尿病模型组腹腔注射STZ 52 mg/kg (临用前用 0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解，pH 4.2)，1次/d，连续5 d。正常对照组仅腹腔注射等体积上述缓冲液。完成STZ注射72 h后，尾静脉采血测空腹血糖并同时测尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者列入DM观察对象[11]。将造模成功的28只(造模过程中死亡4只，死亡原因可能是STZ的毒性作用)雄性大鼠，按体重、空腹血糖随机分为模型对照组(DM组，14只)、雷公藤内酯醇组(TP组，14只)。

2.2 给药方法 雷公藤内酯醇组给予TP混悬液(用少量吐温-80溶解，再加入灭菌生理盐水稀释至所需浓度)1.8 g/kg灌胃，C组和DM组灌服等体积饮用水，连续给药8周，每日上午1次。实验期间大鼠自由饮水、饮食(DM组、TP组明显比C组多饮多食多尿。DM组实验中期死亡1只，原因可能是肺部感染；TP组实验后期有1只死于腹泻；其余动物精神活动均正常)，不使用胰岛素及其他降糖药物。

2.3 生化标本收集 分别于灌胃后第4周、第8周末采用不锈钢代谢笼收集大鼠24 h尿标本，收集时预先将大鼠放入洗净的代谢笼中，收集尿液期间大鼠禁食，自由饮水，尽量减少声、光等对动物的刺激。记录尿液总量后取10 mL，5 000 r/min离心5 min，去除沉渣，用免疫透射比浊法测24 h尿mALB。

2.4 标本制备 实验第8周末，各组大鼠用电子天平称重后，100 mL/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，约5 min后，剪开大鼠腹腔，10 mL注射器心脏取血，尽量取尽全血，迅速取出双肾，肾脏经4 ℃预冷的生理盐水灌洗，至整个肾脏颜色变苍白后游离、去除包膜，称重，取右肾按冠状位纵行剖开，取肾皮质若干块置于4%多聚甲醛固定6 h，移至30% 蔗糖溶液内，放4 ℃冰箱内，待肾组织下沉后，取出OCT包埋，放-80 ℃冰箱内待用。

2.5 Glut的免疫荧光染色 取冠状位肾皮质连续冰冻切片，Glut-1、Glut-4各5张，厚8 μm，用H2O2与纯甲醇浸泡肾片，水洗后滴加BSA封闭液，室温20 min，甩去液体不洗。0.1% TritonX100-PBS浸泡2～3 min，碘化丙啶(PI)浸泡20 min，PBS洗后滴加1∶200的一抗(兔IgG)，37 ℃孵育1 h。漂洗后滴加二抗(FITC标记羊抗兔抗体)，37 ℃孵育20 min。PBS反复漂洗后，甘油-PBS封片，放4 ℃冰箱保存待检。阴性对照用PBS代替一抗。

2.6 Glut检测 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)的氩离子激光系统，同时扫描FITC和PI标记的阳性反应物。扫描参数(机器设定)：激发光波长488 nm，观测光波长518、576 nm，物镜为40倍，Zoom：1.0[12]。经图像分析仪摄像、分析大鼠肾皮质肾小球系膜细胞、上皮细胞Glut-1和Glut-4的表达情况。每张切片系膜细胞和上皮细胞各观察10个视野。计算各视野绿色荧光阳性面积的百分率，以平均阳性率分析各组不同肾区内Glut的表达。

3 结果

3.1 各组大鼠24 h尿mALB定量的变化 灌胃后第4周、第8周，C组24 h尿mALB定量变化不大，DM组、TP组较C组明显增加(P<0.01)，且DM组第8周较第4周亦增加(P<0.01)，TP组第8周较第4周明显降低(P<0.01)。见表 1。

3.2 各组大鼠肾小球系膜细胞和上皮细胞的Glut-1、Glut-4的表达 C组肾小球系膜细胞和上皮细胞的Glut-1表达高于Glut-4。DM组系膜细胞及上皮细胞的Glut-1表达较C组明显增加(P<0.05)，Glut-4的表达明显减少(P<0.05)，差异有统计学意义。与DM组比较，TP组Glut-1表达较低(P<0.01)，Glut-4在系膜细胞的表达有所增高(P<0.05)，其在上皮细胞的表达与DM组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。

表1 大鼠24 h尿mALB定量的变化(mg/24 h)

注：与C组比较，**P<0.01；与第4周比较，##P<0.01

表2 大鼠肾皮质内Glut-1和Glut-4的平均阳性率

注：与C组比较，*P<0.05；与DM组比较，△P<0.05，△△P<0.01

4 讨论

本研究结果显示，DM组随病情进展，24 h尿mALB明显增加，提示肾小球的高滤过功能加强，用TP干预糖尿病大鼠模型4周后，24 h尿mALB减少，治疗8周后，24 h尿mALB进一步减少，表明肾小球的高滤过功能有效改善，也证明TP对减少蛋白尿的产生和延缓糖尿病肾病有较好的治疗作用[13]。

DM组肾小球系膜细胞和上皮细胞的Glut-1的表达均明显增加，Glut-1表达量增加引起过多的葡萄糖进入肾小球系膜细胞和上皮细胞，出现细胞内糖代谢的紊乱，若肾脏内多余糖分无法排除体外，可致系膜细胞肥大，细胞外基质增多，肾小球基底膜增厚，出现蛋白尿。因此，Glut-1的数量和功能状态是决定细胞内糖代谢的一个重要阀门[4]，是DN发生、发展的关键因素。还有研究发现，DN患者肾小球内Glut-1的表达明显增加，其表达强度与肾脏病变程度相关，并呈局灶节段性增强[14]。本实验中，DM组肾小球系膜细胞和上皮细胞的Glut-4表达均明显减少，可进一步加重高糖引起的损害。有报道，DN时系膜细胞Glut-4表达受抑可以导致细胞对葡萄糖转运障碍，引起的一系列变化可使DN病程进入不可逆阶段[15]。因此，糖尿病时，肾小球系膜细胞和上皮细胞Glut-1的表达增高及Glut-4的表达减少均是肾脏受累的重要因素。

本研究中，TP组肾小球系膜细胞和上皮细胞的Glut-1表达均显著降低，表明TP能减少肾小球系膜细胞和上皮细胞的Glut-1的表达，即减少了高糖的直接与间接损伤作用，明显减轻蛋白尿，减轻肾小球肥大和足细胞损伤、肾脏的炎症和氧化应激，同时改善高脂血症和肥胖症[16]，延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的进展并保护肾功能。TP组Glut-4在系膜细胞的表达增高，可促进葡萄糖的转运和利用，从而降低血糖水平[17]。也有研究推测，任何能增加系膜细胞中Glut-4表达、促进Glut-4易位的因素均对糖尿病的肾脏有保护作用[14]。

综上所述，早期应用TP可改善DM大鼠肾脏的组织病理学变化，最终延缓DN的发生和发展，其机制可能与其下调系膜细胞和上皮细胞Glut-1的表达量及功能活性，以及使Glut-4在系膜细胞的表达增高有关。

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Influence of triptolide on the expression of Glut-1,Glut-4 in kidney of diabetic nephropathy rats

YOU Li-ju,GUO Hui,LI Yi-chuan

(Shangqiu Medical College,Shangqiu 476000,China)

Objective To discuss the influence of triptolide on the expression of Glut-1,Glut-4 in kidney of diabetic nephropathy rats.Methods 45 rats were randomly divided into two groups according to weight: normal control group (group C,n=13) and diabetic model group (n=32).Rats in model group were intraperitoneally injected streptozotocin (STZ) 52 mg/kg for 5 d continuously; rats in group C were given intraperitoneal injection of equal volume of the buffer solution.At 72 h after the injection,the levels of fasting blood glucose and urine glucose were detected,and the rats with blood glucose≥16.7 mmol/L,urine glucose more than+++were included as the diabetes objects.The 28 male rats (successful model) were randomly divided into DM model group (DM group,n=14) and triptolide group (TP group,n=14).Results At the 4th and 8th weeks,the 24 h urinary mALB level in DM group and TP group significantly increased than that of group C (P<0.01),the mALB in DM group at the 8th week was higher than that at the 4th week (P<0.01),but the mALB in TP group at the 8th week reduced (P<0.01).The expression of Glut-1 in mesangial and epithelial cells in DM group increased more significantly than that of group C (P<0.05),and the expression of Glut-4 reduced (P<0.05).Compared with DM group,the expression of Glut-1 in mesangial and epithelial cells of group PT was significantly lower (P<0.01),the expression of Glut-4 in mesangial cells increased (P<0.05),no significant difference was found in the expression of epithelial cell (P>0.05).Conclusion Triptolide can significantly reduce the content of Glut-1 in glomerular mesangial and epithelial cells of diabetic nephropathy rats,increase the Glut-4 expression in glomerular mesangial cells.

Triptolide; Diabetic nephropathy; Rats; Glut-1; Glut-4

2014-09-24

商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476000

2011年河南省教育厅自然科学研究计划项目(2011C310003)

10.14053/j.cnki.ppcr.201504004