陶瓷羟基磷灰石去除单抗聚集体的工艺研究

王宁，赵燕燕,Δ，陶文杰，刘丽丽，刘万卉,3

(1.烟台大学 药学院，山东 烟台 264005；2.山东博安生物技术有限公司 抗体技术研究部，山东 烟台 264005；3.绿叶制药集团有限公司 长效和靶向制剂国家重点实验室，山东 烟台 264005)



陶瓷羟基磷灰石去除单抗聚集体的工艺研究

王宁1，赵燕燕1,2Δ，陶文杰2，刘丽丽2，刘万卉1,3

(1.烟台大学 药学院，山东 烟台 264005；2.山东博安生物技术有限公司 抗体技术研究部，山东 烟台 264005；3.绿叶制药集团有限公司 长效和靶向制剂国家重点实验室，山东 烟台 264005)

目的 研究陶瓷羟基磷灰石(ceramic hydroxyapatite，CHT) I型和II型对2种单克隆抗体(monoclonal Ab，mAb)1和2聚集体的去除工艺。方法 层析仪为AKTA AVANT 150，层析柱为Tricon 10/50，先进行CHT I、CHT II 2种填料的动态载样量研究，然后选取合适的载量进行分离纯化研究。上样条件为5 mmol/L磷酸二氢钠(NaH2PO4)，pH 6.5，上样，然后用10 mmol/L NaH2PO4，pH 6.5和10 mmol/L NaH2PO4，2 mol/L NaCl，pH 6.5梯度洗脱来分离单体和聚集体。用分子尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)测定上样蛋白溶液和洗脱峰单体及聚集体的含量。使用20 cm高的XK 16/40的层析柱进行工艺放大研究。结果 mAb 1在CHT I型的载量为40 mg/mL，去除后单体含量为98.6%，工艺收率为92.5%；mAb 2在CHT I型的载量为45 mg/mL，去除后单体含量为98.8%，工艺收率为91.5%；mAb 1在CHT II型载量为16 mg/mL，去除后单体含量为99.8%，工艺收率为91.8%；mAb 2在CHT II型载量为20 mg/mL，去除后单体含量为99.9%，工艺回收率为92.2%。结论 2种类型的陶瓷羟基磷灰石填料在聚集体含量高于10%的情况下，都有很好的去除能力，去除结果符合法规要求。该方法操作简单，能够很顺利的进行工艺放大，满足中试和生产需求。

陶瓷羟基磷灰石；单克隆抗体；纯化工艺；聚集体

近年来，单克隆抗体(简称单抗)已成为世界生物工程制药业的支柱产业之一[1]。在单抗的纯化过程中，如果pH<3，单抗会发生不可逆聚集；盐浓度过高会增加疏水聚集；碱性单抗在多价阴离子缓冲液中易形成稳定的离子复合物，导致单抗之间的聚合；这些过程都可能产生聚集体。单抗中的聚集体是工艺过程中产生的杂质，聚集体过高会促进形成中和单抗、引起血栓等[2-3]。在工业化生产中，为保证终产品的均一性和高比活，简单有效的去除单抗聚集体的方法对提高单抗药物的质量至关重要[4-6]。

聚集体的去除可以通过阳离子交换和疏水层析进行去除，研究发现，当聚集体含量超过10%的时候，阳离子交换树脂和疏水层析很难达到理想的效果，而羟基磷灰石层析方法能够去除单抗中含量较高的聚集体[7-10]。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的分子式为[Ca5(PO4)3OH]2[11]，包括带正电荷的钙离子和带负电荷的磷酸根离子，其与单抗主要有两种作用机制，磷酸根易与单抗中的碱性基团作用，通过增加中性盐离子例如氯化钠会破坏这种作用力，结合的单抗从柱子上解离下来；钙离子与单抗中的酸性基团以金属螯合方式结合，主要通过磷酸盐将吸附的单抗洗脱下来[12]。

本文采用伯乐公司生产的陶瓷羟基磷灰石(ceramic hydroxyapatite，CHT)，对比研究CHT I和CHT II 2种填料对2种单抗(mAb1和mAb2)中聚集体的去除效果。层析条件是伯乐公司提供的单抗聚集体去除的普遍适用条件，经过简单优化[13-14]。单体和聚集体含量测定采用SEC-HPLC方法[15-18]。

1 材料与方法

1.1 单抗 单抗mAb 1和mAb 2，聚集体含量分别为14.5%和12.8%。2种单抗是细胞培养液经过亲和层析纯化后的样品，由山东博安生物技术有限公司抗体技术研发部提供。

1.2 仪器 Cedex Bio生物过程分析仪(Roche公司)；HiprepTM26/10 Desalting脱盐柱(GE Healthcare公司)；TSK-Gel G30000SWxl 凝胶色谱柱7.8 mm×300 mm(东曹公司)；生物安全柜(Heraeus公司)；AKTA AVANT 150(GE Healthcare公司)。

1.3 填料 CHTTMceramic hydroxyapatite，Type I，40 μm；CHTTMceramic hydroxyapatite，Type II， 40 μm(Bio-Rad公司)。

1.4 试剂 氢氧化钠(天津永大化学试剂有限公司)；氯化钠、磷酸二氢钠(天津博迪化工有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 样品处理:5 mmol/L NaH2PO4pH 6.5缓冲液平衡HiprepTM26/10 Desalting柱，使用同一缓冲液洗脱，然后依次用0.2 mol/LNaOH、平衡缓冲液清洗脱盐柱后保存在20%乙醇里。流速4 mL/min。接收洗脱峰，在生物安全柜中使用微孔滤膜过滤后作为上样蛋白。

1.5.2 CHT I、CHT II的单抗动态载量:用2种填料装柱，使用量均为1 mL，取过滤后的蛋白作为测试样品，用缓冲液A(10 mmol/L NaH2PO4pH 6.5)平衡好离子交换柱，CHT I按照载量为30、40、45、50、55 mg/mL上样；CHT II按照载量为10、15、20、25、30 mg/mL上样，分析流穿组分。

1.5.3 CHT I去除2种单抗中的聚集体:取过滤后的蛋白，使用Tricon10/50 (CV4.9 mL) CHT I离子交换柱，缓冲液A为平衡缓冲液，缓冲液A和缓冲液B(10 mmol/L NaH2PO4，2 mol/LNaCl pH 6.5)梯度洗脱(0～50%，40 CV)，收集洗脱峰，然后使用缓冲液C(500 mmol/L NaH2PO4pH 6.5)冲洗柱子上未洗脱下来的成分，收集再生峰[19-20]。流速1 mL/min。检测洗脱峰聚集体含量，计算回收率。

回收率(%)=纯化后单体重量(mg)/纯化前单体重量(mg)×100%

1.5.4 CHT II去除2种单抗中的聚集体：取过滤后的蛋白，使用Tricon10/50(CV4.9 mL)CHT II离子交换柱，缓冲液A为平衡缓冲液，缓冲液A和缓冲液B梯度洗脱(20%～50%，30 CV)，收集洗脱峰，然后使用缓冲液C冲洗柱子上未洗脱下来的成分，收集再生峰[19-20]。流速1 mL/min。检测洗脱峰聚集体含量，计算回收率。

1.5.5 层析柱放大去除2种单抗的聚集体：按照1.5.2和1.5.3方法，使用2种填料分别装填20 cm高XK16/40层析柱，进行放大，收集洗脱峰和再生峰。检测洗脱峰聚集体含量，计算回收率。

1.5.6 蛋白浓度的测定：采用紫外分光光度计在280 nm和320 nm处测定吸光度进行定量，用超纯水在280 nm和320 nm空白校正，分别测定样品在280 nm和320 nm处的吸收值。

公式：A=(A280-A320)样品-(A280-A320)空白

A=ECL；E：摩尔吸光系数；C：样品浓度；L：光程1 cm

1.5.7 SEC-HPLC检测聚集体含量：用0.35 mol/L磷酸钠和0.35 mol/L氯化钠混合溶液，pH 7.2作为流动相，样品用流动相稀释至0.5 mg/mL，微孔滤膜过滤后进样检测。流速0.5 mL/min，检测波长280 nm，进样量100 μL，拖尾因子应为0.95～1.40，按面积归一化法计算供试品中单体和多聚体的含量。

1.6 SEC-HPLC方法学验证

1.6.1 精密度：取供试品连续进样6针，进样分析，记录色谱图，计算峰面积。

1.6.2 准确度：以加样回收率方法计算，制备聚体含量分别为高、中、低的样品各3份，进样分析，记录色谱图，计算峰面积。

1.6.3 线性方称：取高分子量物质(多聚体含量较高的纯化物质)溶液和单体物质(单体含量较高的纯化物质)溶液，按供试品溶液制备项制备。分别连续进样6针，按面积归一化法，分别计算聚体、单体的平均含量。然后以一定比例混合分别配制成聚体含量为0.1%、3.0%、6.4%、9.4%、12.4%、14.2%、16.4%和18.0%的系列溶液，进样分析，以聚体含量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.6.4 重复性：取供试品配制6份，进样分析记录色谱图，计算峰面积。

1.6.5 中间精密度：操作者1和操作者2，分别取供试品配制6份，进样分析，记录色谱图，计算峰面积。

2 结果

2.1 CHT I、CHT II填料对2种单抗的动态载量结果 使用生物过程分析仪分析流穿组分，结果表明CHTI的对mAb 1、mAb 2载量分别为40 mg/mL、45 mg/mL，见图1；CHT II对 mAb 1、 mAb 2载量分别为16 mg/mL、20 mg/mL，见图2。

图1 CHT I 动态结合载量Fig.1 CHT I dynamic binding capacity

图2 CHT II 动态结合载量Fig.2 CHT II dynamic binding capacity

2.2 CHT I、CHT II填料去除2种单抗中聚集体的效果 使用SEC-HPLC分别检测2种单抗的洗脱峰聚集体含量，见图3。结果表明：CHT I纯化 mAb1、 mAb 2的洗脱峰单体含量分别为98.6%、98.8%。，回收率分别为92.5%、91.5%。CHT II纯化mAb 1、mAb 2的洗脱峰单体含量分别为99.8%、99.9%，回收率分别为91.8%、92.2%。

图3 抗体纯化前/后的分子排阻色谱结果A: 抗体1(前) B：抗体2(前) C：抗体1(后) D：抗体2(后)Fig.3 SEC-HPLC chromotagram of mAb before/after purificationA: mAb1 (before) B： mAb2 (before) C： mAb1 (after) D： mAb2 (after )

2.3 SEC-HPLC方法学验证结果

2.3.1 精密度试验结果：精密度试验结果表明RSD值为0.01%，仪器精密度良好。

2.3.2 准确度试验结果：准确度试验结果表明平均回收率分别为88.6%、87.9%、99%，RSD值分别为0.13%、0.01%、0.46%，证明方法准确度良好。

2.3.3 线性曲线：标准曲线的回归方程为：Y=3×106X+275853，R2=0.9997，此方法在聚体含量0.1%～18.0%的范围内呈良好的线性关系。

2.3.4 重复性试验结果：重复性试验结果表明样品的RSD值为0.2%，符合要求。

2.3.5 中间精密度试验结果：不同试验者批内精密度RSD分别为0.14%、0.16%，结果符合中间精密度要求。

2.4 工艺放大结果 使用SEC-HPLC检测2种单抗的洗脱峰中聚集体含量。结果表明：CHT II去除聚集体的效果要优于CHT I，分辨率高，与放大前的结果基本一致，方法重现性好。CHT I、CHT II放大结果见表1。

表1 20 cm XK16/40 层析柱分析结果Tab.1 Results of 20 cm height XK16/40 column

3 讨论

本实验使用CHT I和CHT II 2种类型的陶瓷羟基磷灰石填料去除2种单抗中的聚集体，2种单抗的聚集体含量都高于10%，层析方法经过进一步优化梯度洗脱条件，获得纯度超过98.5%的单体。

载样量实验证明了CHT I载样量高于CHT II。聚集体含量测定采用SEC-HPLC方法，结果显示CHT II纯化后单体比例均高于99.8%，聚集体含量均低于0.2%；CHT I单体比例均高于98.5%，聚集体含量均低于1.5%，而且蛋白的回收率均在90%以上，说明CHT II去除单抗聚集体效果优于CHT I。使用XK16/40层析柱对工艺进行了放大，结果显示方法具有较好的重现性。实验中，层析柱使用多次后出现反压大的问题，需要在每次实验结束后进行彻底的清洗，否则会影响聚集体的去除效果。

使用CHT I和CHT II 2种填料去除多聚体方法简单，容易实现工艺放大。单抗结构在序列上有相当高的一致性，可以在本方法的基础上优化用于去除目标单抗中的聚集体，本文为单抗聚集体的去除提供了实验依据和有利参考。

[1] Reichert JM.Monoclonal antibodies as innovative therapeutics[J].Curr Pharm Biotechnol,2008, 9(6):423.

[2] Mire-Sluis AR,Barrett YC,Devanarayan V,et al.Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products[J].J Immunol Methods,2004,289(1-2) :1-16.

[3] Gupta S,Indelicato SR,Jethwa V,et al.Recommendations for the design,optimization,and qualification of cell-based assays used for the detection of neutraliazing antibody responses elicited to biological therapeutics[J].J Immunol Methods,2007,321(1-2):1-18.

[4] 232ndNational Meeting of the Americal Chemical Society.San Francisco, California USA,2006.

[5] Vázquez-Rey M, Lang DA. Aggregates in monoclonal antibody manufacturing processes[J]. Biotechnol.Bioeng,108(7):1494-1508.

[6] Rosenberg AS.Effects of protein aggregates.an immunologic perspective[J].AAPS J,2006，8 (3) :E501-507.

[7] Josics DJ, Loster K, Kuhl R, et al. Purification of monoclonal antibodies by hydroxyapatite HPLC and size exclusion HPLC[J].Biol.Chem.Hoppe-Seylars,1991,372(3):149-156.

[8] Gagnon P.Monoclonal antibody purification with hydroxyapatite[J].N Biotechnol,2009,25(5): 287-293．.

[9] Sun S.Removal of high molecular weight aggregates from an antibody preparation using ceramic hydroxyapatite chromatography,oral presentation[C]. 3rd International Hydroxyapatite Conference,Lisbon,2003.

[10] Sun S.Ceramic hydroxyapatite chromatography in antibody and Fcfusion protein purification[C]. (Oral presentation). 12th Annual Waterside Conference,San Juan,Puerto Rico.2007.

[11] Gagnon P,Ng P,Zhen J,et al．A ceramic hydroxypatite-based purification platform：simultaneous removal of leached protein A,aggregates,DNA,and endotoxins from mAbs[J].Bioprocess Int,2006,4：50-60.

[12] Chen J,Tetrault J,Zhang YY,et al.The distinctive separation attributes of mixed-mode resins and their application in monoclonal antibody downstream purification process[J].J Chromatogr A,2010,1217 (2)：216-224.

[13] Ng PK,He J,Gagnon P.Mechanistic model for adsorption of immunoglobulin on hydroxyapatite[J].J Chromatogr A,2007,1142 (1)：13-28.

[14] Franklin S.Removal of aggregate from an IgG4 product using CHT ceramic hydroxyapatite.chromatography Tech Note 2940, Bio-Rad Laboritories,Inc.2002.

[15] Luo P,Hayes RJ,Cha I,et al.Development of a cytokine analog with enhanced stability using computational ultrahigh throughput screening[J].Pro Sci,2002,11(5):1218-1226.

[16] kramarczyk JF, kelley BD, coffman JL. High-throughput screening of chromatographic separations:Ⅱ.Hydrophobic interaction[J].Biotechnol Bioeng, 100(4):707-720.

[17] Tosoh Bioscience LLC.Analysis of human immunoglobulins by size exclusion chromatography,application note G00951.

[18] Diederich P,Hansen SK,Oelmeier SA.A sub-two minutes method for monoclonal antibody aggregate quantification using parallel interlaced size exclusion high performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A,2011,1218: 9010-9018.

[19] Gagnon P.Improved antibody aggregate removal by hydroxyapatite chromatography in the presence of polyethylene glycol[J].J Immunol Methods,2008,336 (2):222-228．.

[20] Gagnon P,Beam K.Antibody aggregate removal by hydroxyapatite chromatography[J].Curr Pharm Biotechnol,2009,10 (4): 440-446.

(编校：王冬梅)

Study on the process of ceramic hydroxyapatite for removing monoclonal antibody aggregates

WANG Ning1, ZHAO Yan-yan1,2Δ, TAO Wen-jie2, LIU Li-li2, LIU Wan-hui1,3

(1.School of Pharmacy, Yantai University, Yantai 264005, China; 2.Department of Antibody Technology, BoanBiotech Group Ltd., Yantai 264005, China; 3.State Key Laboratory of Long-acting and Targeting Drug Delivery System, Luye Pharma Group Ltd., Yantai 264005, China)

ObjectiveTo compare the purification process of two types of ceramic hydroxyapatite(CHT I and CHT II)to remove the aggregates from two monoclonal antibodies(mAb 1 and mAb 2).MethodsAll the chromatography runs were performed on AKTA AVANT 150 with Tricon 10/50 column.The dynamic binding capacity(DBC) of two types of CHT was studied firstly, and then purification research was carried out selecting the suitable DBC.The column was equilibrated with 5 mmol/L sodium dihydrogen phosphate pH 6.5, and then was eluted with gradient buffers which were 10 mmol/L sodium dihydrogen phosphate pH 6.5 and 2 mol/L sodium chloride pH 6.5.Aggregate content in loading and elution pool was evaluated by size exclusion chromatography.Scale-up process was carried on 20 cm height chromatography column XK16/40.ResultsDBC of CHT I for mAb 1 was 40 mg/mL and mAb 2 was 45 mg/mL.After purity, monomer content of mAb 1 reached 98.6% and yield was 92.5% and monomer content of mAb 2 reached 98.8% and yield was 91.5% .DBC of CHT II for mAb1 was 16 mg/mL and mAb 2 was 20 mg/mL.After purity, monomer content of mAb 1 reached 99.8% and yield was 91.8% and monomer content of mAb 2 reached 99.9% and yield was 92.2%.ConclusionTwo types of CHT both can remove aggregates effectively from monoclonal antibodies when aggregate content reaches more than 10%, and results conform to the regulations.CHT I has higher dynamic binding capacity than CHT II, and CHT II is superior to CHT I in removing aggregate efficiency.The purification process is simple and can be easily scaled up in pilot and manufacture.Therefore, it meets the requirement pilot and scale production.

ceramic hydroxyapatite; monoclonal antibody; purification process; aggregate

国家863计划(2012AA02A302 )

王宁，女，硕士在读，研究方向：生物制药，E-mail：294316576@qq.com；赵燕燕，通讯作者，女，博士，讲师，研究方向：生物制药，E-mail：zhaoyy@luye.cn。

R367.2

A

1005-1678(2015)05-0177-04