PICK 1在肝纤维化中的表达变化及功能研究

陈培　杰，李　俊，黄　　成，孟晓　明，蔡双朋

PICK 1在肝纤维化中的表达变化及功能研究

陈培杰1，2，3，李俊1，2，3，黄成1，2，3，孟晓明1，2，3，蔡双朋1，2，3

摘要目的研究蛋白激酶C结合蛋白1（PICK1）在小鼠肝纤维及活化的肝星状细胞中的表达变化，并探讨其对人肝星状细胞株（LX-2）活化的影响。方法建立四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化模型，观察PICK1在肝纤维化过程中的表达变化；转化生长因子β1（TGF-β1）刺激LX-2活化，Western blot测定PICK1的蛋白表达情况；转染PICK1过表达质粒至LX-2中，再以TGF-β1诱导活化，Western blot检测PICK1、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原（Col1a1）和Smad2、3及其磷酸化水平的蛋白表达情况。结果正常组小鼠肝脏中PICK1表达较高，随着肝纤维化的加重，PICK1的表达逐渐递减。TGF-β1诱导活化的LX-2细胞中PICK1表达降低。转染PICK1过表达质粒后，TGF-β1诱导的α-SMA、Colla1的表达明显减少，且Smad2、3磷酸化水平显著下降。结论PICK1在纤维化肝组织及活化的HSC中表达下调。过表达PICK1可抑制TGF-β1诱导的LX-2活化，可能是通过抑制TGF-β／Smad通路而发挥作用，为肝纤维化的防治研究提供了新的思路和靶点。

关键词PICK1；肝纤维化；肝星状细胞

2015-06-29接收

李俊，男，博士，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lijun＠ahmu．edu．cn

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是由多种病因引起的肝脏慢性损伤修复反应，以细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的沉积为特征［1-2］。研究［2］显示肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖并活化为肌成纤维细胞是HF发病的核心环节，HSC可以被多种细胞因子激活，其中以转化生长因子β1 （transforming growth factorβ1，TGF-β1）为代表。

蛋白激酶C结合蛋白1（protein interacting with Ca-kinase-1，PICK1）在细胞的增殖、凋亡等多种生理过程中发挥重要作用［3-4］，但其在HF中的表达和功能研究尚没有报道。研究［5］表明PICK1可以负调控TGF-β通路，使细胞对TGF-β1的反应性增强，提示PICK1可能参与了肝纤维化的发展。因此该研究观察PICK1在肝纤维化过程中的表达情况，并转染PICK1质粒，检测α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型胶原（collagen type I，Col1α1）的表达水平，探讨PICK1对HSC活化的作用及作用机制。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物40只雄性C57BL／6J小鼠，普通级，6～8周龄，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1．1．2细胞株人肝星状细胞株（LX-2）由上海中医药大学附属曙光医院徐列明教授馈赠。

1．1．3主要材料与试剂四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）（上海汕头西陇化工厂）；重组人转化生长因子 β1（TGF-β1）（英国PeproTech公司）；DMEM培养液、OPTI-MEM、胎牛血清、胰酶、青-链霉素溶液（美国Gibco公司）；LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；人PICK1质粒（上海吉凯公司）；Rabbit pAb anti-PICK1抗体（美国Abcam公司）；Rabbit anti-Col1α1（北京博奥森公司）；Mouse anti-β-actin（北京中杉金桥公司）；Mouse anti-α-SMA、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H＋L）、山羊抗兔IgG（H＋L）（武汉博士德生物工程有限公司）；化学发光（ECL）试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1．1．4仪器NAPCO-6100型细胞培养箱（美国SHELLAB公司）；SW-CJ-IF型超净工作台（江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；Sigam3-16K高速离心机（美国Sigma公司）；冷冻离心机TGL-18R（珠海黑马医学仪器有限公司）；Western blot设备（美国Biorad公司）。

1．2方法

1．2．1动物分组与肝纤维模型的建立小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型4周组、模型6周组、模型8周组，每组10只。模型组每只小鼠按0．02 ml／g体重腹腔注射10%CCl4（按体积比CCl4∶橄榄油＝1∶9），每周2次，持续4周，之后每周1次。分别于第4、6、8周处死动物。正常对照组小鼠在相同的时间点腹腔注射同等体积的橄榄油。在末次注射24 h后，引颈处死动物，立即摘取部分肝脏-80℃保存备用。另取一部分组织于10%甲醛溶液中固定，用于组织病理学观察。

1．2．2病理学检查取相同部位小鼠肝脏右叶组织，石蜡包埋，切片，分别进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson胶原纤维染色，观察肝脏组织的病理学改变和胶原纤维增生情况，分析和评价CCl4诱导小鼠肝损伤和纤维化程度。

1．2．3LX-2细胞培养和传代LX-2细胞使用含有10%胎牛血清及100 U／ml青霉素和100 mg／ml链霉素的高糖培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞生长融合达到约80%时，用0．25%胰蛋白酶消化传代或按所需浓度接种培养瓶、培养板。

1．2．4LX-2的诱导活化取对数生长期的细胞接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养12 h使细胞贴壁，然后添加终浓度为0、2、5、10 ng／ml的TGF-β1，于培养箱中继续培养24 h使细胞活化。

1．2．5转染LX-2细胞生长融合大约80%时，用Opti-MEM培养液分别稀释LipofectamineTM2000和质粒至所需浓度，室温静置5 min。将稀释后的质粒与LipofectamineTM2000小心吹打混匀，室温再静置20min以形成稳定的质粒-脂质体复合物。随后弃去旧培养液，将上述含有复合物的培养液加入待转染细胞，6 h后更换完全培养基DMEM，并加入TGF-β1（5 ng／m l），继续作用24 h。实验分组为正常组：不做任何处理；模型组：以等体积的Opti-MEM代替转染液；阴性对照组：转染GV144-control空载质粒；PICK1过表达组：转染GV144-PICK1质粒。

1．2．6Western blot检测蛋白水平收集肝组织及处理后的细胞，加入 RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，4℃、12 000 r／min离心30 min，取上清液进行蛋白定量后加入上样缓冲液，100℃加热10 min使蛋白变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后按蛋白分子量大小切胶转膜，以5%的脱脂奶粉室温封闭3 h，Tris-HCl-Tween（TBST）洗膜后，分别用相应的抗体（1∶500）孵育，次日，膜用TBST清洗后，用与一抗种属相匹配的的二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂盒显影，以β-actin为内参，Image J软件扫描并分析蛋白质表达相对含量。

1．3统计学处理采用SPSS 13．0软件进行分析，数据以±s表示，用One-Way ANOVA检验各组间差异的显著性。

2　结果

2．1小鼠肝纤维化进程中肝脏病理学改变

2．1．1小鼠肝组织大体观察正常对照组小鼠肝脏表面光滑、柔软，边缘锐利，颜色呈红棕色，可以看见肝组织中有丰富的血管。模型组小鼠肝脏肿胀偏大，质地较硬，表面粗糙，且可以看到有中等量到大量的灰黄色的结节。

2．1．2肝脏组织学改变HE染色及Masson染色显示：正常对照组小鼠肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，未见病理性改变，只有极少量细小的蓝色纤维组织，位于血管周围。CCl4造模4周后肝小叶结构开始紊乱，并伴有脂肪空泡，有少量胶原纤维沉积。造模第6周可见肝小叶结构破坏，并伴有大量脂肪空泡，纤维间隔明显增厚，形成假小叶。造模第8周肝小叶结构明显破坏，肝脏出现广泛的脂肪变性。提示小鼠肝纤维化模型建立成功。见图1。

2.2PICK1在CCl4诱导的小鼠肝纤维化组织中的蛋白表达Western blot结果显示，正常对照组小鼠肝组织PICK1表达量较高，模型组小鼠肝组织PICK1表达量较正常对照组明显降低，并且随CCl4造模时间的延长及纤维化程度加重，表达量逐渐下降，差异有统计学意义（F＝193．123，P＜0．05）；α-SMA在肝组织中的表达及变化趋势与其相反，与正常对照组比较差异有统计学意义（F＝464．929，P＜0．05）。见图2。

2.3TGF-β1诱导的肝星状细胞中PICK1蛋白表达Western blot检测结果显示，TGF-β1诱导LX-2细胞活化后，α-SMA蛋白表达显著增加，与正常对照组比较差异有统计学意义（F＝80．04，P＜0．05），但PICK1蛋白较正常对照组表达则显著下降（F＝8．932，P＜0．05）。见图3。

2.4过表达PICK 1对TGF-β1诱导的肝星状细胞活化的影响Western blot结果显示，转染 GV144-PICK1质粒后，LX-2细胞内PICK1蛋白表达水平与阴性对照组相比显著升高，差异有统计学意义（F＝14．458，P＜0．05）。与正常组比较，模型组α-SMA蛋白水平明显升高（F＝57．34，P＜0．01），Col1α1蛋白水平也显著上升（F＝24．539，P＜0．01），提示TGF-β1成功诱导LX-2细胞活化。而转染GV144-PICK1质粒后，α-SMA蛋白水平较阴性对照组显著下降（F＝57．34，P＜0．01），Col1α1蛋白水平也明显降低（F＝24．539，P＜0．01）。表明过表达PICK1可以抑制TGF-β1诱导的LX-2的活化。见图4。

2.5过表达PICK 1对TGF-β1诱导的肝星状细胞中Sm ad2和Sm ad3磷酸化水平的影响为了进一步研究PICK1的作用机制，笔者进一步检测了PICK1过表达后，LX-2中Smad2、3及二者的磷酸化水平，Western blot结果显示，与正常组比较，模型组Smad2蛋白磷酸化水平显著升高（F＝82．289，P＜0．05），Smad3蛋白磷酸化水平也显著上升（F＝8．732，P＜0．05）；而转染GV144-PICK1质粒后，Smad2蛋白磷酸化水平显著下降（F＝82．289，P＜0．05），Smad3蛋白磷酸化水平也明显降低（F＝8．732，P＜0．05）。见图5。

3　讨论

研究［6-7］表明TGF-β1是肝纤维化最重要的始动因子之一，TGF-β1可以促进HSC增殖活化及ECM的合成，其主要通过TGF-β／Smad通路发挥效应，因此拮抗TGF-β1对细胞的作用、抑制TGF-β／Smad通路对于抗肝纤维化研究至关重要。

研究［5］显示PICK1能够负调控TGF-β／Smad通路，影响细胞对TGF-β1的反应性。因此，本研究首先建立了小鼠肝纤维化模型，发现PICK1在正常对照组表达量较高，而随着肝纤维化程度的加重，PICK1的表达逐渐降低，与α-SMA表达趋势相反，提示PICK1可能参与了肝纤维化的发展。然后课题组应用TGF-β1诱导LX-2活化并检测PICK1的蛋白水平，结果显示TGF-β1诱导LX-2活化后，PICK1较正常组明显降低，这与小鼠纤维化肝组织检测结果一致，表明PICK1可能参与了HSC的活化。为进一步明确其在HSC中的作用，本实验室转染PICK1质粒，观察PICK1对LX-2活化及胶原分泌的影响，Western blot结果显示随着PICK1表达水平的增加，α-SMA及Col1α1的蛋白表达水平较阴性对照组均显著降低，表明过表达PICK1可以明显抑制 TGF-β1诱导的LX-2的活化和胶原的分泌。有研究［5］报道，敲除 PICK1，小鼠胚胎成纤维细胞对TGF-β1反应会明显增强，TGF-β1引起的细胞形态改变更加显著、细胞迁移能力明显增强，本研究结果与之一致。另外有研究［4-5］显示PICK1的表达情况通常与TGF-β通路蛋白呈明显负相关，过表达PICK1可明显抑制TGF-β1的转录活性及Smad2的磷酸化，并且PICK1可通过抑制TGF-β通路，拮抗TGF-β1对乳腺癌细胞的效应，参与乳腺癌的发生发展。因此，笔者推测PICK1影响HSC的活化可能与TGF-β／Smad通路有关，为此课题组检测了TGF-β／Smad通路蛋白的表达变化，结果显示过表达PICK1后，Smad2及Smad3磷酸化水平显著下降，表明在LX-2中PICK1可以抑制TGF-β／Smad通路，并且这可能是PICK1参与肝纤维化病程的机制之一。

参考文献

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The expression and effect of PICK1 in liver fibrosis

Chen Peijie1，2，3，Li Jun1，2，3，Huang Cheng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，2Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University；3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo explore the expression of protein interactingwith Ca-kinase-1（PICK1）in fibrotic liver of mice and activated hepatic stellate cell，and investigate the effect of PICK1 on the activation of hepatic stellate cell strain（LX-2）．MethodsLiver fibrosismodel in mice was induced by CCl4 and then the PICK1 levelwas detected in fibrotic liver tissue．LX-2 cells were activated by transforming growth factorβ1（TGF-β1），and the protein level of PICK1 was detected by Western blot．After transfected with the plasmid expressing PICK1，LX-2 was stimulated with TGF-β1，the levels ofα-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（Col1a1），Smad2，3 and phosphorylation level of them were determined by Western blot．ResultsPICK1 was highly expressed in normalliver tissues and progressively down-regulated as liver fibrosis progressed．The expression of PICK1 was down-regulated in activated LX-2 induced by TGF-β1．The hepatic stellate cell transfected with PICK1-plasmid showed remarkablely decreased TGF-β1-inducedα-SMA and Col1a1 expression and obviously declined phosphorylation levels of Smad2 and Smad3．ConclusionThe expression of PICK1 decreases in fibrotic livers and activated hepatic stellate cell．Over-expression of PICK1 can suppress the activation of hepatic stellate cell induced by TGF-β1，and probably because of the inhibitory effect on TGF-β／Smad pathway，which provides new ideas and targets for the prevention and treatment of liver fibrosis．

Key wordsPICK1；Liver Fibrosis；hepatic stellate cell

中图分类号R 322．47；R 329．25；R 575；R 965

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1606-05

基金项目：国家自然科学基金（编号：81273526、81473268）；安徽省重点科技攻关项目（编号：1301042212）；安徽省自然科学基金（编号：1308085MH145）；高等学校博士学科点专项科研基金（编号：20123420120001）

作者单位：安徽医科大学1药学院、2肝病研究所，3安徽省创新药物产业共性研究院，合肥230032

作者简介：陈培杰，女，硕士研究生；