前列腺素E1预处理对大鼠SMA急性缺血再灌注损伤保护的研究

2015-07-21 07:52曹志新赵德银
安徽医科大学学报 2015年10期

曹志新,刘 斌,赵德银

前列腺素E1预处理对大鼠SMA急性缺血再灌注损伤保护的研究

曹志新,刘斌,赵德银

摘要目的研究前列腺素E1(PGE1)预处理在大鼠肠系膜上动脉(SMA)急性缺血再灌注损伤(IRI)中对小肠细胞的保护作用。方法18只健康雄性SD大鼠随机平均分为对照组、假手术组、实验组。采用夹闭SMA 1 h再灌注2 h的方法建立大鼠急性肠IRI模型,对照组仅暴露SMA。假手术组标准建模。实验组于再灌注前从尾静脉注入20μg/kg的PGE1。光镜下观察小肠变化并采用Chiu氏6级评分法评分。肠管黏膜细胞进行HE检查,并检测相关凋亡蛋白Bax、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的表达,同时检测血清中肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)、二胺氧化酶(DAO)的变化。结果HE检测显示对照组镜下未见明显变化;假手术组绒毛上皮粘膜缺失、破溃并出血坏死;实验组肠粘膜损伤较轻,坏死、脱落少见,与假手术组比较,实验组Chiu氏评分明显低于假手术组。假手术组、实验组Bax、Bcl-2表达均高于对照组(P<0.05),实验组表达明显低于假手术组(P<0.05)。假手术组、实验组血清IFABP、DAO含量均高于对照组(P<0.05),实验组血清IFABP含量低于假手术组(P<0.05)。结论PGE1能减轻大鼠SMA急性IRI所致小肠的坏死程度,保护受损的小肠黏膜。

关键词肠系膜上动脉;急性缺血;缺血再灌注损伤;前列腺素E1

肠道缺血再灌注损伤(ischemical reperfusion injury,IRI)是指严重的肠道动脉缺血一定时间后,血供恢复造成组织损伤加重的一种现象。急性肠系膜上动脉(superiormesenteric artery,SMA)栓塞患者是外科急重症之一,手术死亡率达60%~85%,与小肠IRI密切相关[1]。IRI中肠黏膜肠绒毛顶部是对缺血低氧最敏感、最易损伤的部位[2]。该实验通过建立大鼠SMA急性IRI模型,予以前列腺素E1 (prostaglandin E1,PGE1)预处理,从小肠黏膜病理学,细胞凋亡及血清中大鼠肠脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,IFABP)和二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)不同方面比较,研究PGE1对SMA急性缺血后对小肠IRI损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1主要药物、试剂与仪器

PGE1规格10μg:2 m l,购自北京泰德制药有限公司;DAB显色试剂盒、Bax一抗、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,

2015-05-22接收

1.2实验动物

18只健康雄性SD大鼠,SPF级,体重350~420 g,购自安徽医科大学实验动物中心。术前标准环境适应饲养1周。

1.3方法

1.3.1分组与模型制备

18只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、假手术组、实验组,每组6只。所有大鼠术前禁食12 h,自由饮水。10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉,麻醉满意后,备皮固定于手术台。术野消毒铺巾,取上腹部正中切口逐层进腹,显露SMA。采取扎闭肠系膜上动脉1 h再灌注2 h的方法建模[3],对照组仅显露 SMA,术毕直接取材;假手术组标准建模;实验组于再灌注前从尾静脉注入20μg/kg PGE1,余同假手术组。严格无菌操作。SMA夹闭期间,间断向腹腔内注射约15 ~20 ml/kg生理盐水,预防再灌注时出现一过性低血容量反应。关腹后再向腹腔内追加25~30 m l/kg生理盐水(含32万U庆大霉素/L)用以扩容及预防可能的腹腔感染。术毕再灌注2 h取标本及抽血。

1.3.2免疫组化(SABC)法检测

采用SABC三步法测定每组、各时间点肠管Bax、Bcl-2的水平表达,操作严格按照试剂盒说明进行。并用细胞内有明显黄色/棕黄色颗粒判定为阳性对照。每组随机选取6张切片,400倍不连续视野下任意选取3个视野进行图像分析。采用Image Pro Plus6.0图像分析软件测定Bax和Bcl-2的吸光度(optical density,OD)值,以平均OD值做为Bax和Bcl-2的测量值。

1.3.3病理形态学观察

每组大鼠切取病变肠管回肠段约4 cm,肠腔清洗后用10%福尔马林固定。脱水,石蜡覆盖,制作切片。常规HE染色,于40倍显微镜下观察肠管的形态学、病理学变化。并进行Chiu氏评分。0分:正常小肠粘膜绒毛;1分:上皮下间隙增大,通常在小肠绒毛的顶端,伴有毛细血管淤血;2分:上皮下间隙扩张,伴有上皮层和固有层的中度分离;3分:绒毛两侧上皮层和固有层大量分离,部分绒毛顶端破损;4分:绒毛破损伴有固有层毛细血管暴露,部分固有层的细胞成分增多;5分:固有层破坏及不完整,出血及溃疡。

1.3.4血清DAO及IFABP测定

于再灌注2 h后抽取大鼠血液样本,所有血液样本以3000 r/min离心10 min,取上清液。严格按照试剂盒说明操作。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析,数据以±s表示。组间采用单因素方差分析。

2 结果

2.1大体观察

对照组大鼠肠组织鲜活红润,小动脉搏动有力,肠蠕动正常,绒毛完整,排列整齐,无明显出血溃疡;假手术组夹闭1 h后肠管颜色呈暗红色,蠕动减慢或消失,有臭味,肠管内见血性渗出,肠腔扩张、淤血,肠黏膜充血坏死;绒毛与固有层分离,绒毛破溃脱落;实验组夹闭1 h后肠管呈灰红色,蠕动减慢,肠管内少量血性渗出,绒毛与固有层发生分离的较少,部分形成出血及溃疡,绒毛部分脱落,表现较假手术组明显减轻。见图1。

2.2Chiu氏评分的组间比较

对照组仅开腹,SMA未做任何处理,Chiu氏评分为0;假手术组正常建模,Chiu氏评分为(4.52±0.33)分;实验组于再灌注前行PGE1预处理,Chiu氏评分为(2.62± 0.35)分。

2.3免疫组化法检测Bax、Bcl-2的表达

各组方差分析差异有统计学意义(FBax=377.484、FBcl-2=212.060、FBcl-2/Bax=121.853,P<0.05)。再灌注2 h后与对照组比较,假手术组和实验组肠管Bax、Bcl-2的表达呈上升趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组较假手术组的表达明显降低,有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2。

表1 3组 Bax、Bcl-2及比值的表达情况(n=6,±s)

表1 3组 Bax、Bcl-2及比值的表达情况(n=6,±s)

与假手术组比较:*P<0.05;与对照组比较:#P<0.05

组别Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax对照0.076±0.005 0.193±0.009 2.545±0.192假手术 0.541±0.041 0.584±0.041 1.081±0.036实验 0.245±0.031*# 0.347±0.039*# 1.436±0.219*#

2.4血清IFABP及DAO含量变化

各组方差分析差异有统计学意义(FIFABP=233.814、FDAO=94.317,P<0.05)。再灌注2 h后假手术组、实验组大鼠血清IFABP、DAO较对照组显著增加(P<0.05),实验组较假手术组降低(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠血清 IFABP及 DAO含量变化(n=6,pg/ml,±s)

表2 大鼠血清 IFABP及 DAO含量变化(n=6,pg/ml,±s)

与假手术组比较:*P<0.05;与对照组比较:#P<0.05

组别IFABP缺血前  再灌注2 h DAO缺血前  再灌注2 h对照 34.707±0.495 38.593±4.610 12.482±0.695 13.951±2.678假手术 34.905±1.534 429.402±39.521# 12.885±0.860 43.112±3.951#实验 40.383±1.649 301.801±38.396*#15.052±0.819 26.163±4.260*#

3 讨论

急性SMA以SMA栓塞常见,临床表现为严重的急腹症。虽然在早期诊断和血管重建方面做了相当大的努力,各大医学中心报告病死率仍然高达80%[1],不仅因为本病多不能及时诊断和处理,还与IRI损伤密切相关,如何及时诊断和合适的处理是临床亟待解决的问题之一。本实验采用PGE1预处理研究PGE1对SMA急性缺血的保护作用。

PGE1是血管内皮细胞分泌的血管舒张剂,通过激活腺苷酸环化酶使血管平滑肌松弛,并且抑制交感神经末梢释放去甲肾上腺素使血管扩张。另外PGE1可以抑制中性粒细胞激活和氧自由基、超氧化物产生,达到抑制减轻炎症反应。PGE1具有改善胃肠粘膜血流量,改善胃肠急性缺血产生的副作用,保护消化道黏膜等作用[4]。

细胞凋亡是肠IRI整个病理发展过程的关键因素之一。通过检测肠组织细胞凋亡相关蛋白,可以反映大鼠SMA急性缺血后肠管损伤情况。Bcl-2/Bax的比值决定着凋亡的情况[5-6]。Bcl-2蛋白表达上升,Bax表达下调,Bcl-2/Bax上升则抑制细胞凋亡。本研究显示,假手术组、实验组与对照组比较都呈现高表达,说明肠IRI中肠管细胞凋亡增加。肠管损伤严重。实验组相对假手术组呈现低表达(P<0.05),说明PGE1预处理的实验组细胞凋亡较假手术组轻,PGE1预处理对小肠粘膜细胞具有保护作用。

IFABP是小肠损伤的血清标志物之一。研究[7]显示小肠缺血性疾病患者的血清和尿液中IFABP呈明显升高趋势,而且和缺血严重程度及时间呈正相关性。本研究通过PGE1干预,检测相同时间点血清中的IFABP浓度,假手术组和实验组较对照组明显升高。说明假手术组和实验组都存在明显的肠管缺血损伤。实验组较假手术组降低(P<0.05),说明PGE1干预的实验组肠管缺血损伤程度较假手术组轻。

DAO是具有高度活性的细胞内酶,大部分位于空肠、回肠的粘膜绒毛上,正常血浆中DAO含量很低。当肠黏膜受损时DAO可以很快的进入血液循环,导致血浆中DAO含量急剧升高[8],外周血中DAO含量能反映肠黏膜的损伤程度及肠黏膜的完整性[9]。本实验结果显示假手术组、实验组血清中DAO含量均明显高于对照组,说明均存在IRI。实验组预先给予PGE1干预,其血清中DAO含量明显低于假手术组(P<0.05),表明实验组肠IRI较假手术组减轻。

参考文献

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[4]Mitsuyoshi A,Obama K,Shinkura N,et al.Survival in nonocclusive mesenteri ischemia:early diagnosis by multidetector row computed tomography andearly treatment with continuous intravenous highdose prostaglandin E(1)[J].Ann Surg,2007,246(2):229-35.

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[7]Kanda T,Tsukahara A,UekiK,etal.Diagnosis of ischemic small bowel disease bymeasurementof serum intestinal fatty acid-binding protein in patientswith acute abdomen:amulticenter,observer-blinded validation study[J].JGastroenterol,2011,46(4):492 -500.

[8]Swank G M,Deitch E A.Role of the gut in multiple organ failurep:bacterial translocation and permeability changes[J].World JSurg,1996,20(4):411-7.

[9]Nathan B P,Nisar R,Short J,et al.Delayed olfactory nerve regeneration in ApoE-deficient mice[J].Brain Res,2005,1041 (1):87-94.

中图分类号R 574

文献标志码A

文章编号1000-1492(2015)10-1409-04

作者单位:安徽医科大学第一附属医院普通外科,合肥230022

作者简介:曹志新,男,硕士研究生;刘斌,男,副教授,副主任医师,硕士生导师,责任作者,E-mail:13399519008@163.comBcl-2)、链霉亲和素生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC)免疫组化染色试剂盒;DAO测定试剂盒,IFABP免疫组化检测试剂盒均购自武汉博士德生物有限公司。

The effect of pretreatment with prostaglandin E1 on acutemesenteric ischem ia and reperfusion injury

Cao Zhixin,Liu Bin,Zhao Deyin
(Dept of General Surgery,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei230022)

AbstractObjectiveTo study the pretreatmentwith prostaglandin E1(PGE1)on acute superiormesenteric artery(SMA)ischemia reperfusion injury of intestinal cell in rats.Methods18 healthymale SD ratswere random ly divided into control group,sham operation group and experimental group.IRIof SMAmodelwasmade by clamping the SMA for one hour and two hours after reperfusion in the control group and the experimental group,respectively.PGE1(20μg/kg)was injected from the tail vein in the control group and the experimental group.Character of pathology of small intestine was examined.The expression of Bax and Bcl-2 in small intestine cells and change of IFABP and DAO in serum were detected.Resu ltsPathologic changes showed that therewas no change in the control group;while in the sham operation group,chorionic epithelium mucosa ulceration and hemorrhage and necrosis occurred more seriously than that in the experimental group.Expression of Bax and Bcl-2 was higher in the sham operation group and the experimental group than that in the control group(P<0.05),and itwas obviously lower in the experimental group than in the sham operation group(P<0.05).The content of IFABP and DAO in blood serum:itwas higher in the sham operation group and the experimental group than in the control group(P<0.05),and itwas lower in the experimental group than in the sham operation group(P<0.05).ConclusionPGE1 can relieve the alvine necrosis caused by rats’mesenteric reperfusion injury after acute artery ischemia and thus protect damaged mucosa of small intestine.

Key wordssuperiormesenteric artery;acute ischemia;ischemia reperfusion injury;prostaglandin E1