鬼针草总黄酮部分化学成分研究

邓子云，陈飞虎，李　宁，高文凡，赵　杰，韩　续，雷　静，葛金芳，李晓祥

鬼针草总黄酮部分化学成分研究

邓子云1，陈飞虎1，李宁1，高文凡1，赵杰1，韩续1，雷静1，葛金芳1，李晓祥2

摘要目的对鬼针草中的化学成分进行分离纯化，并筛选出具有抗肝纤维化活性的单体化合物。方法采用大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、MCI小孔树脂、十八烷基硅烷键合硅胶柱等柱层析的方法进行分离纯化，并利用波谱技术进行化合物的鉴定。应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法体外检测单体化合物对肝星状细胞T6（HSC-T6）的抑制作用。结果从鬼针草中分离鉴定的化合物为3-羟基乙酰基吲哚（1）、山奈酚（2）、6，7，3′，4′-四羟基橙酮（3）、槲皮素（4）、奥卡宁（5）、松脂素（6）、1，2，13-三羟基-3，11（E）-十三二烯-5，7，9-三炔（7）、异奥卡宁（8）、邻苯二甲酸-双（2′-乙基庚基）酯（9）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（10）、（2S／2R）-异奥卡宁-7-O-β-D-（2″，4″，6″-三乙酰基）吡喃葡糖苷（11／12）、2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-1，13-二羟基-3，11（E）十三二烯-5，7，9-三炔（13）。结论化合物6，9为首次从鬼针草种属中分离得到。其中黄酮类化合物2，4具有较强的体外抑制HSC-T6细胞的增殖作用。

关键词鬼针草；化学成分；结构鉴定；肝星状细胞T6

鬼针草（Bidens bipinnata L．）是菊科一年生草本植物，分布在亚洲的热带和亚热带地区，在我国的华东、华中、华南、西南各省区也有较为广泛的分布。鬼针草为我国民间常用草药，有解热清毒、散瘀活血的功效，常用于呼吸道感染、急性黄疸型肝炎、胃肠炎、风湿关节疼痛等的治疗。研究［1］表明鬼针草具有抗炎、抗糖尿病、抗高血压、抗肝纤维化等作用。为了明确鬼针草药效的物质基础，该研究对鬼针草总黄酮提取物的化学成分进行了系统的分离，并将得到的化合物进行初步的活性的筛选，为进一步开发鬼针草提供科学依据。

1　材料与方法

1．1药材

鬼针草于秋季采自安徽省绩溪县，经安徽医科大学药学院中药学教研室张群林教授鉴定，属于菊科鬼针草属鬼针草Bidens bipinnata L．。

1．2仪器与试剂

AM-300、400，DRX-500型核磁共振光谱仪（瑞士Bruker公司，四甲基硅烷作为内标）；HPD 100大孔树脂（河北宝恩公司）；Sephadex LH-20（瑞典GEHealthcare Bio-Sciences公司）；MCI小孔树脂（日本Mitsubishi Chemical公司）；十八烷基硅烷键合硅胶柱（octadecylsilyl，ODS，日本Fuji Silysia Chemical公司）；柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）；薄层色谱GF254硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）；氘代试剂（美国Sigma-aldrich公司）；肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）-T6细胞株（南京凯基生物科技发展有限公司）；转化生长因子-β1（美国PeproTech公司）；胎牛血清、DMEM高糖液体培养基（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMSO、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（美国Sigma公司）；表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）（北京世纪奥科生物技术有限公司）。

1．3方法

1．3．1分离提取

鬼针草干燥全草55 kg用70%乙醇溶液提取2次，提取液蒸发至无醇味后过HPD 100大孔树脂，用三倍柱体积双蒸水和70%乙醇溶液作为洗脱剂，收集70%乙醇溶液洗脱部分，蒸干后得到浸膏1．8 kg。浸膏用水分散，再次过HPD 100大孔树脂，用10%～100%乙醇溶液进行洗脱，共得到5个部分，标记为B1-B5。B4（120 g）部分经正相硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯－甲醇系统洗脱，得到4个部分，标记为 B4（1）-B4（4）。B4（2）部分经Sephadex LH-20吸附，用水-甲醇系统梯度洗脱得到化合物1（11．45 mg）和化合物7（28．27 mg）。B4（3）部分经Sephadex LH-20、MCI（0～100%甲醇）梯度洗脱得到化合物2（6．65 mg）。B4 （4）部分经Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脱得到B4（4）-1和 B4（4）-2。B4（4）-1部分经Sephadex LH-20吸附，用纯乙醇系统洗脱得到化合物4（12．4 mg）和化合物5（16．5 mg）。B4（4）-2经

2015－03－31接收

室，合肥230032

2安徽省新星药物开发有限责任公司，合肥200060

1．3．2MTT法检测细胞增殖

取对数增殖期的HSC-T6细胞，以5 000个／孔的细胞密度接种于96孔培养板中，空白对照组加入等量培养基不接种细胞，放入37℃、5%CO2培养箱中12 h细胞贴壁后，空白对照组加入等体积的培养基，药物组加入等体积不同浓度的药物（药物终浓度为12．5、25、50、100、200μmol／L）培养48 h后，每孔加入20 ml MTT溶液（5 mg／m l），在37℃、5%CO2的培养箱中继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入150 ml DMSO，震荡10 min后用酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度（absorbance，A）值。

2　结果

2．1结构鉴定

化合物1：白色结晶状粉末，分子式为C10H9NO2，1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：8．22 （m，1H，H-4），8．17（s，1H，H-2），7．45（m，1H，H-7），7．22（m，2H，H-5，H-6），4．72（s，2H，-CH2OH）。13C-NMR（101MHz，MeOD）δ：195．93（C ＝O），138．16（C-7a），133．98（C-2），126．88（C-3a），124．34（C-4），123．26（C-5），122．63（C-6），114．82（C-3），112．92（C-7），66．24（-CH2OH）。以上数据与文献［2］对比，确定化合物 1为 3-羟基乙酰基吲哚。

化合物2：黄色粉末，分子式为C15H10O6，1HNMR（400 MHz，Acetone）δ：12．17（s，1H，OH-5），8．16（d，J＝8．5 Hz，2H，H-2′，H-6′），7．02（d，J＝8．5 Hz，2H，H-3′，H-5′），6．54（d，J＝2．0 Hz，1H，H-6），6．27（d，J＝2．0 Hz，1H，H-8）。13C-NMR（101 MHz，Acetone）δ：177．01（C-4），165．51（C-7），160．65（C-5），159．91（C-4′），158．80（C-2），158．10 （C-9），136．45（C-3），130．98（C-2′，C-6′），123．78（C-1′），116．84（C-3′，C-5′），104．35（C-10），99．68（C-6），95．01（C-8）。以上数据与文献［3］对比，确定化合物2为山奈酚。

化合物3：红色粉末，分子式为C15H10O6，10%硫酸乙醇溶液显色呈红色。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：7．52（s，1H，H-2′），7．39（d，J＝8．2 Hz，1H，H-6′），7．18（d，J＝8．3 Hz，1H，H-4），6．86 （d，J＝8．2 Hz，1H，H-5′），6．71（d，J＝8．2 Hz，1H，H-5），6．60（s，1H，H-10）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ：185．27（C-3），156．84（C-6），156．10（C-8），149．35（C-4′），147．95（C-2），146．64（C-3′），131．43（C-7），126．48（C-6′），125．60（C-1′），119．31（C-2′），116．90（C-4），116．67（C-5′），116．22（C-9），114．73（C-10），113．58（C-5）。以上数据与文献［4］对比，确定化合物3为6，7，3′，4′-四羟基橙酮。

化合物 4：淡黄色粉末，分子式为C15H10O7，10%硫酸乙醇溶液显色呈红色。1H-NMR（400 MHz，Acetone）δ：7．83（d，J＝2．0 Hz，1H，H-2′），7．70 （dd，J＝8．5，2．0 Hz，1H，H-6′），6．99（d，J＝2．0 Hz，1H，H-5′），6．52（d，J＝2．0 Hz，1H，H-8），6．26（d，J＝2．0 Hz，1H，H-6）。13C-NMR（101 MHz，Acetone）δ：176．76（C-4），165．14（C-7），162．52（C-5），157．95（C-9），148．53（C-4′），147．13（C-2），146．01（C-3′），136．96（C-3），123．97（C-1′），121．65（C-6′），116．43（C-5′），115．97（C-2′），104．34（C-10），99．34（C-6），94．65 （C-8）。以上数据与文献［5］对比，确定化合物4为槲皮素。

化合物5：橘红色粉末（甲醇），分子式为C15H12O6，10%硫酸乙醇溶液显色呈黄色。1H-NMR（400 MHz，Acetone）δ7．74（d，J＝15．3 Hz，2H，H-α，H-β），7．65（d，J＝7．4 Hz，1H，H-5′），7．33（d，J ＝1．8 Hz，1H，H-2），7．19（dd，J＝1．8，8．2 Hz，1H，H-6），6．88（d，J＝8．2 Hz，1H，H-5），6．48 （d，J＝8．9 Hz，1H，H-6′）。13C-NMR（101 MHz，Acetone）δ：193．35（C＝O），154．20（C-2′），152．53（C-3′），149．21（C-4），146．35（C-β），145．52（C-4′），133．18（C-3），128．19（C-1），123．51（C-6），123．15（C-5′），118．38（C-а），116．45（C-2），116．03（C-5），114．73（C-1′），108．27（C-6′）。以上数据与文献［6］对比，确定化合物5为2′，3′，4′，3，4-五羟基查尔酮（奥卡宁）。

化合物6：棕黄色粉末，分子式为C20H22O6，10%硫酸乙醇溶液显色呈色黄色。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ：6．94（d，J＝1．7 Hz，2H，H-2，2′），6．81（dd，J＝8．2，1．7 Hz，2H，H-6，6′），6．78（d，J＝8．2 Hz，2H，H-5，5′），4．68（d，J＝4．2 Hz，2H，H-7，7′），4．20（dd，J＝8．2，6．7 Hz，2H，H-9a，9′a），3．84（s，6H，2×OCH3），3．33 （m，2H，H-9b，9′b），3．11（m，2H，H-8，8′）。13CNMR（101 MHz，MeOD）δ149．06（C-3，3′），147．24（C-4，4′），133．76（C-1，1′），120．02（C-6，6′），116．05（C-5，5′），110．90（C-2，2′），87．44（C-7，7′），72．56（C-9，9′），56．36（-OCH3），55．30（C-8，8′）。以上数据与文献［7］对比，确定化合物6为松脂素。

化合物7：黄色粉末，分子式为C13H12O3，1HNMR（400 MHz，MeOD）δ6．49（d，J＝16．3 Hz，1H，H-12），6．50（m，1H，H-3），5．88（d，J＝18．3 Hz，1H，H-4），5．82（s，1H，H-11），4．16 （m，3H，H-1a，H-13a，H-2），3．38（m，2H，H-1b，H-13b）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ150．31（C-12），150．25（C-4），109．30（C-3），107．76（C-11），78．29（C-10），78．08（C-9），75．04（C-8），74．69 （C-7），73．35（C-2），66．63（C-6），66．45（C-5），66．39（C-13），62．59（C-1）。以上数据与文献［8］对比，确定化合物7为1，2，13-三羟基-3，11（E）-十三二烯-5，7，9-三炔。

化合物8：棕黄色粉末，分子式为 C15H12O6，1HNMR（400 MHz，MeOD）δ：7．25（d，J＝8．7 Hz，1H，H-5），6．95（d，J＝1．7 Hz，1H，H-2′），6．81 （dd，J＝8．1，1．7 Hz，1H，H-6′），6．75（d，J＝8．1 Hz，1H，H-5′），6．48（d，J＝8．7 Hz，1H，H-6），5．31（dd，J＝12．2，3．0 Hz，1H，H-2），3．02（dd，J ＝16．8，12．6 Hz，1H，H-3ax），2．67（dd，J＝16．9，3．0 Hz，1H，H-3eq）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ：194．07（C-4），153．97（C-7），152．65（C-9），146．84（C-4′），146．39（C-3′），133．92（C-8），131．86（C-1′），119．59（C-6′），119．35（C-5），116．19（C-5′），115．61（C-10），114．98（C-2′），110．87（C-6），81．50（C-2），44．97（C-3）。以上数据与文献［9］对比，确定化合物8为异奥卡宁。

化合物9：淡黄色油状液体，分子式为C26H42O4，1H-NMR（300 MHz，DMSO）δ：7．67（dd，J＝6．0，3．2 Hz，2H，H-3，6），7．66（dd，J＝6．0，3．2 Hz，2H，H-4，5），4．10（m，4H，H-1′，1″），1．52 （m，2H，H-2′，2″），1．23（m，18H，10×CH2），0．86（t，J＝4．2 Hz，6H，H-9′，9″），0．82（t，J＝3．6 Hz，6H，H-7′，7″）。13C-NMR（75 MHz，DMSO）δ：167．02（C＝O），131．73（C-1，2），131．64（C-4，5），128．69（C-3，6），67．43（C-1′，1″），38．10（C-2′，2″），29．82（C-3′，3″），29．06（C-4′，4″），28．39（C-5′，5″），23．27（C-6′，6″），22．43（C-8′，8″），13．93 （C-7′，7″），10．83（C-9′，9″）。以上数据与文献［10］对比，确定化合物9为邻苯二甲酸-双（2′-乙基庚基）酯。

化合物10：黄色粉末，分子式为 C21H20O10，1HNMR（300 MHz，MeOD）δ：7．71（d，J＝8．8 Hz，2H，H-2′，6′），6．88（d，J＝8．8 Hz，2H，H-3′，5′），6．30（d，J＝2．0 Hz，1H，H-8），6．13（d，J＝2．0 Hz，1H，H-6），5．33（d，J＝1．6 Hz，1H，H-1″），4．20（dd，J＝3．3，1．7 Hz，1H，H-2″），3．70（d，J ＝3．3 Hz，1H，H-3″），3．29（m，1H，H-4″），3．27 （m，1H，H-5″），0．89（d，J＝5．6 Hz，2H，H-6″）。13C-NMR（75 MHz，MeOD）δ：179．52（C-4），165．86（C-7），163．13（C-5），161．49（C-4′），159．18（C-2），158．45（C-9），136．17（C-3），131．88（C-2′，6′），122．59（C-1′），116．46（C-3′，5′），105．86（C-10），103．44（C-1″），99．82（C-6），94．75（C-8），73．17（C-4″），72．08（C-3″），71．98 （C-5″），71．90（C-2″），17．64（C-6″）。以上数据与文献［11］对比，确定化合物10为山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物11／12：浅黄色粉末，分子式为C27H28O14，1H-NMR（300 MHz，MeOD）δ：7．36（d，J＝8．8 Hz，1H，H-5），6．98（d，J＝1．7 Hz，1H，H-2′），6．88（d，J＝8．4 Hz，1H，H-6），6．85（d，J＝7．9 Hz，1H，H-5′），6．80（dd，J＝8．0，1．8 Hz，1H，H-6′），5．42（dd，J＝9．5，8．0 Hz，1H，H-2″），5．16（d，J＝7．6 Hz，1H，H-1″），5．08（dd，J＝16．5，7．0 Hz，1H，H-4″），5．01（dd，J＝12．4，2．8 Hz，1H，H-6″b），4．30（dd，J＝12．2，5．2 Hz，1H，H-6″a），4．12（dd，J＝12．4，2．0 Hz，1H，H-6″b），4．09～3．99（m，1H，H-3″），3．85-3．75（m，1H，H-5″），3．12（dd，J＝16．6，11．9 Hz，1H，H-3），2．82（dd，J＝16．6，2．8 Hz，1H，H-4），2．06 （s，3H，CH3，OAc），2．02（s，3H，CH3，OAc）。13C-NMR（75 MHz，MeOD）δ：193．98（C-4），172．27（C＝O，OAc），172．01（C＝O，OAc），171．44 （C＝O，OAc），152．66（C-），152．50（C-9），151．80 （C-7），147．81（C-3′），146．97（C-4′），146．50（C-5′），136．65（C-8），131．62（C-1′），119．62（C-6′），118．35（C-5），116．22（C-10），115．03（C-2′），110．60（C-6），101．98（C-1″），81．69（C-2），75．38 （C-2″），73．11（C-3″），72．76（C-5″），69．94（C-4″），63．17（C-6″），44．92（C-3），21．29（CH3，OAc），20．77（CH3，OAc），20．63（CH3，OAc）。以上数据与文献［12］对比，确定化合物11／12为（2S／2R）-异奥卡宁-7-O-β-D-（2″，4″，6″-三乙酰基）吡喃葡糖苷。

化合物13：黄色粉末，分子式为C19H22O7，1HNMR（300 MHz，MeOD）δ：6．40（dt，J＝15．8，4．1 Hz，1H，H-12），6．15（d，J＝1．0 Hz，1H，H-3），6．11（dd，J＝16．0，1．0 Hz，1H，H-4），5．94 （dd，J＝11．1，4．0 Hz，1H，H-11），4．55（d，J＝7．7 Hz，1H，H-1′），4．50（m，1H，H-2），4．26（s，2H，H-13），3．80（m，1H，H-6′a），3．67（s，1H，H-6′b），3．62（d，J＝4．4 Hz，2H，H-1），3．34～3．19（m，4H，H-2′～H-5′）。13C-NMR（75 MHz，MeOD）δ：147．57（C-12），146．62（C-4），109．99 （C-3），109．15（C-11），102．11（C-1′），79．53（C-2），78．82（C-10），78．14（C-9），77．90（C-3′），77．44（C-5′），76．83（C-8），75．57（C-7），75．01（C-2′），71．50（C-4′），67．10（C-6），65．71（C-5），62．59（C-1），62．02（C-6′），19．09（C-13）。以上数据与文献［13］对比，确定化合物13为2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-1，13-二羟基-3，11（E）十三二烯-5，7，9-三炔。

2.2抑制HSC-T6增殖活性的筛选

通过MTT法检测分离提取得到的黄酮类化合物对HSC-T6细胞活性的影响，结果表明与阳性对照药EGCG比较，化合物2（山奈酚）、4（槲皮素）对HSC-T6细胞具有较强的抑制增殖作用。半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）见表1。

表1　黄酮类化合物对　HSC-T6细胞抑制效应的　IC50值（n＝3，±s）

表1　黄酮类化合物对　HSC-T6细胞抑制效应的　IC50值（n＝3，±s）

化合物　IC50（μmol／L）38．41±9．37 3 ＞200 4 40．44±3．81 5 ＞200 6 58．83±4．48 8 88．10±8．06 10　165．57±6．27 11／12　198．53±9．93 2 EGCG　48．92±5．84

3　讨论

肝纤维化是肝脏内弥漫性细胞外基质过度沉积。HSC是细胞外基质的主要来源。正常情况下HSC处于静止状态，当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，HSC被激活，其表型由静止型转变为激活型，并转化为肌成纤维细胞样细胞，合成细胞外基质增多导致肝纤维化。因此，HSC是肝纤维化的重要参与者［14］。

本课题组前期研究［15］显示总黄酮提取物对肝纤维化具有一定的治疗作用。为了明确鬼针草药效物质基础，本实验对鬼针草总黄酮提取物的化学成分进行了系统的分离，并从四五部分分离得到13个化合物。分别是3-羟基乙酰基吲哚（1）、山奈酚（2）、6，7，3′，4′-四羟基橙酮（3）、槲皮素（4）、奥卡宁（5）、松脂素（6）、1，2，13-三羟基-3，11（E）-十三二烯-5，7，9-三炔（7）、异奥卡宁（8）、邻苯二甲酸－双（2′-乙基庚基）酯（9）、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（10）、（2S／2R）-异奥卡宁-7-O-β-D-（2″，4″，6″-三乙酰基）吡喃葡糖苷（11／12）、2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-1，13-二羟基-3，11（E）十三二烯-5，7，9-三炔（13）。其中化合物6，9为首次从鬼针草种属中分离得到。将得到的单体化合物进行体外抗纤维化活性筛选，显示化合物2（山奈酚）、4（槲皮素）具有较强的体外抑制HSC-T6细胞的增殖作用，这为进一步开发鬼针草抗纤维化活性提供科学依据。

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中图分类号R 348

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1456－05

基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项课题（编号：2009ZX09103-386）

作者单位：1安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级实验

作者简介：邓子云，女，硕士研究生；陈飞虎，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：cfhchina ＠sohu．com；李宁，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：ln0110 ＠sina．comMCI吸附，用水－甲醇系统梯度洗脱得到化合物3 （24．15 mg）。B5（320 g）部分经正相硅胶柱层析，氯仿－甲醇系统洗脱，得到5个部分，标记为B5 （1）-B5（5）。B5（1）-B5（3）部分经Sephadex LH-20（0～100%甲醇）、MCI（30% ～100%甲醇）、硅胶柱（氯仿甲醇）梯度洗脱得到化合物6（30．02 mg）、化合物8（57．84mg）和化合物9（12．4mg）。B5（4）部分经Sephadex LH-20（0～100%甲醇）、MCI（30% ～100%甲醇）梯度洗脱后，经Sephadex LH-20吸附，用纯乙醇系统洗脱得到化合物13（1．83 g）和化合物11／12（25．4 mg）。B5（5）部分经Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脱后，经ODS柱吸附，用水－甲醇系统洗脱得到化合物10（60 mg）。

Chem ical constituents from Bidens bipinnata L.

Deng Ziyun，Chen Feihu，Li Ning，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Anhui Provincial Laboratory on Bioactivity of Natural Products，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo isolate and identify chemical constituents from Bidensbipinnata L．and screen for the anti-fibrosis activity．MethodsThe extracts were passed through HPD-100 macroporous resin columns with 100% water and 70%ethanol following bymacro resin HPD-100，silica gel column chromatography，Sephadex LH-20，MCIand ODS chromatography．The structures of the componentswere elucidated by NMRmethods．The proliferation of HSC-T6 cells was evaluated by MTT．Results13 components were isolated from the plant including 3-（hydroxyacetyl）indole（1），Kaempferol（2），6，7，3′，4′-tetrahydroxy-aurone（3），Quercetin（4），Okanin（5），Pinoresinol（6），（3E，11E）-tetradecadiene-5，7，9-tetrayn-1，2，13-triol（7），Isookanin（8），bis（2-ethylheptyl）phythalate（9），kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside（10），（2S／2R）isookanin-7-O-β-D-（2″，4″，6″-triacetyl）glucopyranoside（11／12），2-O-β-D-glucosyltri-deca-3，11E-en-5，7，9-tetrayn-1，13-diol（13）．Conclusion13 components are isolated from Bidens bipinnata L．，among which compounds 6，9 are isolated from this genus for the first time and compounds 2，4 could inhibit the proliferation of HSC-T6 cells．

Key wordsBidens bipinnata L．；chemical compounds；structure identification；HSC-T6 cells