足底电击诱导树鼠句条件恐惧记忆模型的建立及抹除

郭呈斌，张　晨，2，王烈成

足底电击诱导树鼠句条件恐惧记忆模型的建立及抹除

郭呈斌1，张晨1，2，王烈成1

摘要目的探索足底电击诱导树鼩条件恐惧记忆模型的建立及抹除方法。方法测定在无刺激条件下，树鼩在明暗箱中的活动规律；然后用梯度刺激实验测定合适的足底电击电压；最后用合适的电压通过足底电击诱导并建立实验组树鼩条件恐惧记忆模型并抹除其记忆。结果正常条件下，树鼩（n＝4）在暗箱中的停留时间明显多于明箱中的停留时间（P＜0．01）；在两明箱中，足底电压梯度刺激实验显示，随着刺激电压的增加，树鼩（n＝6）在有刺激的隔间中的停留时间逐渐减少。12 V以后树鼩在有刺激隔间与无刺激隔间的停留时间差异有统计学意义［12 V（P＜0．05）、16 V（P＜0．01）、20 V（P＜0．01）］；实验组（n＝4）暗箱用16 V刺激电压足底电击能够形成明显的恐惧记忆（P＜0．001）。在形成明显的恐惧记忆后，在明箱中给予相应的足底电击4 d，实验组（n＝4）树鼩在明箱中停留的时间逐渐减少，与对照组比较差异无统计学意义。结论树鼩更趋于停留在暗箱中；16 V为较为适合的足底电击电压；条件恐惧记忆能够被诱导并且被新的刺激完全抹除。

关键词树鼩；足底电击；条件恐惧记忆形成和抹除；明暗箱中图分类号 R 338．2＋7；R 33-33

树鼩（Tupaia belangeri）是一种小型哺乳动物，属于哺乳纲，攀鼩目（Scandentia）［1］。主要分布在热带和亚热带地区［2－3］。树鼩身体内的分子、细胞及解剖结构较猫、犬、鼠等动物更接近于人类［3］。研究［4－5］显示，在猕猴和树鼩中均能形成人类阿尔兹海默症病理样的老年斑，这在小鼠中是不能形成的。生物信息学分析［2］显示，人类与树鼩在阿尔兹海默病有关基因具有较高的同源性，这些结论为人类研究阿尔兹海默病提供了良好的实验对象。该研究旨在探索树鼩在足底电击刺激下形成条件恐惧记忆，以及该恐惧记忆的抹除方法，建立树鼩条件恐惧记忆动物模型，为进一步研究树鼩动物模型提供理论依据。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物

雄性成年中缅树鼩，体重120～180 g。购自昆明实验动物研究所，饲养室温度22～25℃，相对湿度55%～75%，12 h光照／12 h黑暗的昼夜循环。动物在进行此实验前没有进行过其他的实验。实验操作均在实验动物操作及福利规范范围内进行。

1．1．2实验装置

实验装置见图1，有2个一样的隔室。动物逐个进行测试，在每只动物测试结束后，用75%的酒精进行清洗以消除不同动物之间气味等相互影响。录像用的摄像机固定在天花板上。在实验装置的底部有数列铜质电极，电极之间间隔1．5 cm，电刺激的电压由稳压电源（0～30 V）提供。装置的四面由聚丙烯注塑材料制成，装置的上面由一层不锈钢网制成，以防止树鼩逃跑及方便录像。每个隔室的内径尺寸为40 cm×40 cm×40 cm，在每个隔室的背面都装有发光二极管（light emitting diode，LED），能够在需要的时候为每个隔室提供照明。整个实验装置处于黑暗的环境中，LED开的隔室称为明箱，LED关的隔室称为暗箱。

1．2实验方法

1．2．1树鼩在明暗箱中的活动规律探索（实验1）

实验包含3个阶段：训练阶段、适应阶段和实验阶段。在训练阶段，所有的动物在无电刺激的情况下每天允许在明暗箱中自由活动30min；在适应阶段，

2015－03－31接收

1．2．2树鼩足底电击不同电压的测定（实验2）

该实验2个隔室皆为明室（即都用LED提供照明）。这个实验由2个阶段组成：适应阶段和测试阶段。适应阶段的实验和实验1相应的阶段一致。3 d适应性训练之后进行测试阶段的实验。在测试阶段，动物有10 min的测试时间，在这10 min内，随机选择1个隔室给予电刺激。电刺激的程序为：每隔30 s给10 s的电刺激，电压从0 V递增至20 V，增幅为4 V（图2 A），通过箱底部的电极电击动物的足底。所有实验动物在测试完1个电压水平后再进行下一水平电压的测试。

1．2．3树鼩条件恐惧记忆的建立（实验3）

该实验由4个阶段组成：适应阶段、刺激前记录阶段、给予一刺激形成恐惧记忆阶段、恐惧记忆维持阶段。适应阶段的处理和实验2适应阶段一致。在恐惧记忆形成阶段，将一适合的刺激电压电击动物足底以形成条件恐惧，该阶段共持续5 d（图3，0～4 d），每天每只动物记录1次。该阶段结束后刺激即移除，记录继续即过渡到恐惧记忆维持阶段。在所有实验中，明暗箱的选择是随机的。刺激程序为：10 min内每隔30 s给予10 s一合适恒压电刺激。对照组不给刺激。

1．2．4树鼩条件恐惧记忆的抹除（实验4）

在实验组动物形成条件恐惧7周后，启动记忆抹除实验。该实验包括3个阶段即条件恐惧记忆维持阶段、恐惧记忆抹除阶段和记忆抹除后维持阶段。在恐惧记忆抹除阶段，在明箱中给予一适合刺激电击动物的足底，观察条件恐惧消退情况。该阶段共持续4 d（图4，0～3 d），每只动物每天记录1次，该阶段结束后则过渡到下一阶段即记忆抹除后维持阶段。在所有实验中，明暗箱的选择是随机的。刺激程序为：10 min内每隔30 s给予10 s一合适恒压电刺激。对照组不给刺激。

1．2．5数据收集

实验均在14∶00～18∶00之间进行的。在测试阶段的10 min内，动物在每个隔间内的活动情况由摄像机记录，通过行为学分析软件EthoVision XT 9（荷兰瓦赫宁根大学Noldus公司）进行分析，统计出动物在每个间隔内的停留时间、移动速度、移动距离等。当树鼩通过两隔室间隔板时，规定以动物的中心为参考点进行统计处理。

1．3统计学处理

2　结果

2．1树鼩明暗箱活动规律探索

在没有任何刺激情况下，让树鼩（n＝4）在明暗箱中自由活动。结果表明，树鼩在暗箱中停留时间为（476．773± 26．965）s，而明箱中只有（117．075±31．176）s。在暗箱中的停留时间是明箱中的4倍多，这表明，日常生活中，树鼩更喜欢在暗箱中停留（t＝6．281，P＜0．01）。

2．2树鼩足底电击合适电压的探究

在两相同的明室中，一室内给予不同电压足底电击，树鼩（n＝6）表现出不同的活动特征。0、4、8 V电压下，树鼩在2个隔室中的停留时间差异均无统计学意义（P ＞0．05）。当电压增大到12 V时，树鼩在有电刺激的隔间停留时间与0 V时的停留时间比较开始明显缩短（t＝3．429，P＜0．05）。随着刺激电压的加大，树鼩在有电刺激的隔间停留时间越来越少［16 V（t ＝5．763，P＜0．01）、20 V（t＝7．117，P＜0．001）］，见图2B。树鼩的其他活动指标如移动距离在6个电压梯度下差异无统计学意义（P＞0．05）。移动速度在16 V前差异无统计学意义（P＞0．05），20 V时移动速度差异有统计学意义（t＝3．176，P＜0．05）。为了获得显著差异结果并且对树鼩动物福利的保护，在接下来的实验中选用16 V电压进行刺激。

2．3树鼩条件恐惧记忆的形成

动物随机分为实验组（n＝4，暗箱中给予足底电刺激）和对照组（n＝4，无电刺激）。结果显示，在刺激前，实验组树鼩在明箱中停留时间所占比例约为16．67%，而对照组的约为23．44%，两者比较无统计学意义（P＞0．05）；在记忆形成阶段，实验组树鼩在没有电刺激的明箱中的停留时间逐渐增加，与对照组比较前2 d （0～1 d）差异无统计学意义（P＞0．05），第3天以后差异有统计学意义，而对照组无变化。随着刺激的继续，实验组树鼩在明箱中停留的时间逐渐增加，稳定后实验组树鼩在明箱中的停留时间随天数的变化与对照组比较有统计学意义［F（22，132）＝7．690，P＜0．001］，表明恐惧记忆已形成。见图3。

2．4树鼩条件恐惧记忆的抹除

在结束恐惧记忆维持阶段后，启动记忆抹除实验。实验动物分组不变，但与恐惧记忆形成实验不同的是实验组是在明箱中给予16 V的足底电击。结果显示，在抹除刺激施加前，实验组树鼩在明箱中停留时间所占比例约为83．8%而对照组约为20．19%，两者比较有统计学意义（P＜0．05）；在恐惧记忆抹除阶段，实验组树鼩在有电刺激的明箱中的停留时间逐渐减少，而对照组无变化。最后稳定在与对照组无差别水平，两组树鼩在明箱中停留时间随天数的变化无统计学意义［F（11，66）＝1．641，P＞0．05］，表明抹除阶段过后，实验组动物的条件恐惧记忆被完全抹除，树鼩条件恐惧记忆的抹除过程见图4。

3　讨论

研究［6］表明，树鼩是一种昼行性动物。但实验1结果表明，树鼩更喜欢呆在暗箱中而不是停留在明箱中。可能是因为树鼩胆子比较小，在暗箱中停留较多时间符合树鼩的活动特征。

学习记忆是一种高级的神经活动［3，7］。动物等级越高，其学习记忆功能就越复杂。痛觉和恐惧是通过不同的方式进行编码的，但是有些地方是有交集的。比如痛觉刺激对恐惧记忆的形成有深远的影响［8－9］。因此，足底电击是进行恐惧记忆研究最常用的手段［10］。对树鼩学习记忆方面的研究如水迷宫实验［11］，或食物诱导［12－13］，但这些实验都只能从某些方面测试树鼩的学习记忆能力，对条件恐惧的痛觉记忆目前还没有很好的实验方法来检测。树鼩作为灵长类的近亲，脑部的发育比啮齿类更接近于人类［2］。本研究进行了足底电击诱导条件恐惧记忆的形成及抹除实验。实验2探讨树鼩足底电击的合适电压。结果表明，树鼩对12 V的电压就有一定的反应，但速度的明显变化是在16 V以上。综合各方面的因素及动物福利，将诱导条件恐惧的足底电击电压定在16 V。

巴普洛夫恐惧记忆理论认为，恐惧记忆的形成经历3个阶段：诱导与建立、强化和维持、消退［14］。本实验采用足底电击刺激树鼩诱导其建立对暗箱的条件恐惧记忆，结果显示树鼩的这种条件恐惧记忆存在时间超过8周而未消退。研究［8］表明新的重大刺激能够使人或动物忘记原有的恐惧记忆，因此在记忆抹除阶段，在相反的箱子给予树鼩刺激，以期树鼩能够抹除其恐惧记忆。结果显示，在相反的箱子给予刺激后，树鼩选择性地抹除原来对暗箱的恐惧记忆，在随后的维持阶段并不是新旧两种记忆共存，而是彻底地抹除了恐惧记忆。本实验显示，新的重大环境变化可以抹除某些恐惧记忆，这就为将来治疗恐惧症提供了一个方向。

由于实验规模的限制，本实验未能对恐惧记忆形成的分子机制进行研究。在将来的研究中，将着重对恐惧记忆形成及抹除的分子机制展开探索，为将来临床上治疗恐惧症提供理论指导。

参考文献

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文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1426－05

基金项目：国家自然科学基金（编号：81071075）；生物膜与膜生物工程国家重点实验室开放课题

作者单位：1安徽医科大学基础医学院生理学教研室，合肥2300322北京大学生命科学学院生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京100871

作者简介：郭呈斌，男，硕士研究生；王烈成，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：wangliecheng＠ahmu．edu．cn动物被允许进行环境及实验节奏的适应，共持续3 d；在实验阶段，每只动物进行10 min的测试（每次测试记录前有3 min的适应时间以消除应激反应带来的误差）。训练阶段和适应阶段的数据不做统计。实验中随机使用1个隔室作为暗箱以消除系统误差。每次实验结束后每只树鼩有1小块糖果（约5 g）作为奖励。

A novel fear conditioning memory model formation and erasing by foot-shock in tree shrew

Guo Chengbin1，Zhang Chen1，2，Wang Liecheng1
（1Dept of Physiology，School of Basic Medical Science，AnhuiMedical University，Hefei230032；2State Key Laboratory of Biological Membrane and Membrane Biological Engineering，College of Life Sciences，Peking University，Beijing100871）

AbstractObjectiveTo investigate the way of fear conditioning memory model evoked and erased by foot-shock in tree shrew．MethodsFirst，detect the tree shrew activities regularly in light／dark box．Second，testa suitable voltage degree of foot shock on tree shrew．Third，investigate thememory formation and erasing of fear conditioning on tree shrew of trial group．Resu ltsThe duration of tree shrew（n＝4）stay in the dark-box was significantly longer than that of in the light box（P＜0．01）in normal condition．In the same environment of two light boxes，given different voltage degrees，the durations of tree shrew（n＝6）stay in the stimulating chamber gradually reduced and the durations of tree shrew stay had significant difference between stimulatus chamber and no stimulatus chamber when the stimulus voltage up to 12 V（P＜0．05），16 V（P＜0．01）and 20 V（P＜0．01）．The animal of trial group（n＝4）could build up the fear conditioningmemory of the dark box with the stimulus of 16 V foot-shock in the dark box（P＜0．001）．After formation of the fear conditioning memory，the same stimulus in light box appeared for 4 days．The durations of tree shrew stay in trial group（n＝4）decreased in light box，and there was nosignificant difference between the trial group and the control group．ConclusionTree shrew prefers to stay in the dark box．The suitable voltage for foot-shock on tree shrew is 16 V．The fear conditioningmemory can be evoked and erased by foot-shock．

Key wordstree shrew；foot-shock；fear conditioningmemory formation and erasing；light／dark box