RCE－4结构改造及其抗肿瘤活性的研究

卢小丰 尉小琴 刘呈雄 黄年玉 邹 坤

（三峡大学 生物与制药学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002）

甾体皂苷是自然界中分布很广的一种天然有机化合物，具有广泛的生理活性.关于甾体皂苷药理活性涉及了很多方面，如对血液系统的作用、抗真菌、抗炎和抗肿瘤等［1－2］.例如：蒺藜用于治疗高血压、眼病、腹胀、皮癣和气管炎［3］，Dracaena draco被用于抗腹泻和止血［4］，Chlorophytum malayense对肿瘤有潜在的细 胞毒活性［5］，Takashi Ohtsuki等［6］从 Calamus insignis中提取了5种甾体皂苷，并发现他们都具有抑制细胞生长和细胞分裂的作用.甾体皂苷的结构比较复杂，但苷元母核一般为螺甾烷型或呋甾烷型，呋甾烷型苷元在酶水解的条件下可转化为螺甾烷型苷元.同样，螺甾烷型苷元在一定的酸水解条件下也可以转化为呋甾烷型苷元［7］.甾体皂苷的糖基主要以D－葡萄糖、D－半乳糖、L－鼠李糖、D－木糖、L－阿拉伯糖为主，最近也有关于甾体皂苷含芹糖的报道［8］.本实验室在前期研究过程中，从吉祥草根茎中获得一个含量大且具有很好的细胞毒活性的甾体皂苷RCE－4，即25 （S）－5β－spirostan－1β，3β－diol1－O－α－L－rhamnopyranosyl－（1→2）－β－D－xylopyranoside（如图1所示）.

图1 RCE－4

RCE－4体外对Caski肿瘤细胞株具有较好的细胞毒活性，IC50为3.71μM.在此基础上，对RCE－4进行了结构改造，通过水解得到皂苷元.在皂苷上进行氯代，得到1－单氯代和1，3－双氯代两个产物.在皂苷元上进行氧化，得到1－位氧化产物和1，3－位双氧化产物两个产物.利用核磁、质谱、红外等方法对所有化合物进行了结构表征，并利用经典的MTT方法，对目标化合物进行了体外抗肿瘤活性的检测.初步探讨了其构效关系，对以后的实验设计指明了方向，为同类化合物的结构修饰提供了支持.合成路线如图2所示.

图2 合成路线图

1 实验部分

1.1 主要实验仪器及材料

1H－NMR，13C－NMR 用 Bruker Ultra－shied TM 400MHz核磁共振仪测定，TMS为内标；红外用Perkin－Elemer PE－983红外光谱仪测定；MS用Finnigan Trace质谱仪测定；熔点用北京第三光学仪器厂生产的X4熔点仪测定，温度未经矫正；所有试剂均为分析纯级别，有机溶剂均为分析纯试剂，从国药集团化学试剂公司购买；实验室所需实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 25（S）－5β－螺甾烷－1β，3β－二醇（a）的合成

称取RCE－4（710mg，1mmol）于反应瓶中，加入1mol／L盐酸（1，4－dioxane：H2O＝1∶1）50mL，70℃搅拌3h.50mL氯仿萃取3次，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色固体，柱层析分离（乙酸乙酯／石油醚＝1∶5）得到化合物a，白色固体，收率：293.3mg（68%）；熔点295～297℃，IR（KBr，cm－1）：3280，2950，2886，1463，1094，1056，985.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.36－4.42（m，1H），4.17（s，1H），3.93－3.96（m，1H），3.84（s，1H），3.28－3.32（d，J＝11.2Hz，1H），3.03（s，2H），1.25－2.06（m，25H），1.12（s，3H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.98（d，J＝7.2Hz，3H），0.76（s，3H）；13CNMR（CDCl3，400MHz）：δ109.7，80.8，73.8，68.4，65.1，62.1，56.2，42.1，41.9，40.4，40.2，39.7，35.5，33.7，32.1，31.7，30.4，27.0，26.1，26.0，25.9，25.7，20.7，18.8，16.4，16.0，14.2.MS（ESI）m／z431.1［M－H］－.

1.3 25（S）－5β－螺甾烷－1α－氯－3β－羟基（b）和25（S）－5β－螺甾烷－1α，3α－二氯（c）的合成

称取化合物a（432mg，1mmol）于反应瓶中，60 mL氯仿作为溶剂，加入二氯亚砜0.5mL，催化量吡啶，常温搅拌1.5h.水洗，氯仿萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色固体，柱层析分离（乙酸乙酯／石油醚＝1∶8）得到化合物b，白色固体，收率：184.8mg（51%），熔点196～198℃.IR（KBr，cm－1）：2952，2927，2876，1449，1187，1051，921.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.91（s，1H），4.67（d，J＝3.6Hz，1H），4.37－4.42（m，1H），3.93－3.96（m，1H），3.29（d，J＝10.8Hz，1H），2.55－2.60（m，1H），2，34－2.38（m，1H），1.09－2.03（m，26H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.98（d，J＝6.8Hz，3H），0.77（s，3H）；13C－NMR（CDCl3，400 MHz）：δ109.7，83.9，80.6，76.8，65.1，62.0，56.0，42.1，41.3，40.2，39.9，39.7，35.0，32.1，32.0，31.7，27.0，26.7，25.9，25.7，25.4，24.6，20.6，18.3，16.3，16.0，14.2.MS（ESI）m／z 451.8［M＋H］＋.

柱层析分离（乙酸乙酯／石油醚＝1∶12）得到化合物c，白色固体，收率：173.4mg（41%），熔点：258～261℃.IR（KBr，cm－1）：2927，2876，1449，1187，1051，921.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.71（s，1H），4.46（d，J＝4.0Hz，1H），4.37－4.43（m，1H），3.92－3.96（m，1H），3.59－3.63（m，1H），3.29（d，J＝9.6Hz，1H），1.24－2.09（m，25H），1.16（s，3H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.98（d，J＝6.8Hz，3H），0.77（s，3H）；13C－NMR（CDCl3，400MHz）：δ109.7，80.6，79.8，72.8，65.1，62.1，56.0，42.1，41.2，40.2，40.1，39.9，35.0，32.6，32.4，31.7，27.0，26.7，25.9，25.7，25.5，22.5，20.6，18.3，16.3，16.0，14.2.MS（ESI）m／z 467.3［M＋H］＋.

1.4 25（S）－5β－螺甾烷－1－羰基－3β－羟基（d）和25（S）－5β－螺甾烷－1，3－二酮（e）的合成

称取化合物a（432mg，1mmol）于反应瓶中，30 mL氯仿作为溶剂，加入新制PCC（645mg，3mmol），常温搅拌4h.抽滤，水洗，CHCl3萃取，合并有机相，无水Na2SO4干燥，浓缩得到黄色固体，柱层析分离（乙酸乙酯／石油醚＝1∶6）得到化合物d，白色固体，收率：116.7mg（27%），熔点247～249℃.IR（KBr，cm－1）：3370，2924，2861，1696，1377，1057，985.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.48（s，1H），4.38－4.44（m，1H），3.91－3.96（m，1H），3.30（d，J＝10.8Hz，1H），2.75－2.79（m，1H），1.18－2.36（m，25H），1.17（s，3H），1.07（d，J＝7.2Hz，3H），0.97（d，J＝6.8Hz，3H），0.75（s，3H）；13CNMR（CDCl3，400MHz）：δ214.1，109.7，80.7，69.3，65.1，62.0，56.2，52.8，45.5，42.9，42.0，40.7，39.8，38.0，35.0，32.9，31.5，29.6，27.0，26.4，25.9，25.7，22.6，16.3，16.0，15.3，14.2.MS（ESI）m／z453.0［M＋Na］＋.

柱层析分离（乙酸乙酯／石油醚＝1∶10）得到化合物e，黄色固体，收率：192.1mg（44%），熔点250～253℃.IR（KBr，cm－1）：2940，2865，1161，1546，1453，1224，1184，1065，987.1H－NMR（CDCl3，400MHz）：δ4.39－4.43（m，1H），3.92－3.96（m，1H），3.58－3.63（t，J＝6.8Hz，1H），3.24－3.31（m，2H），3.04－3.11（m，1H），2.32－2.38（m，1H），1.16－2.09（m，25H），1.08（d，J＝7.2Hz，3H），0.97（d，J＝4.0Hz，3H），0.75（s，3H）；13CNMR（CDCl3，400MHz）：δ207.2，203.2，109.7，80.6，65.1，61.9，56.4，56.0，52.0，42.7，42.5，42.1，40.7，39.7，37.1，34.8，31.4，27.0，25.9，25.7，25.4，25.2，22.8，16.4，16.0，15.8，14.2.MS（ESI）m／z427.1［M－H］－.

2 结果与讨论

2.1 合成方法讨论

RCE－4是由苷元和一个二糖连接的化合物，在确定其具有良好的抗肿瘤活性后，致力于研究和探讨苷元母体对其本身抗肿瘤活性的影响，所以计划水解掉糖链，继而在其母体上进行结构修饰.利用1mol／L的HCl溶液在70℃搅拌3h，即可将糖链水解除掉，得到RCE－4苷元.

得到的苷元在1－位和3－位分别具有一个羟基，计划在羟基上对次结构进行一定改造.利用SOCl2再加入弱的亲核试剂吡啶，反应可产生氯负离子，可得到从反式进攻羟基的产物，机理如图3所示.

图3 反应机理

在实验过程中，也进行了缚酸剂的筛选，从较多缚酸剂中发现Et3N和吡啶的效果相对较好，产率相对较高，而吡啶又是其中产率最高的.Et3N可以充当缚酸剂，但产率相对吡啶来说就要低些，但是吡啶毒性较大，所以在量相对较少，对产率要求不是很高的时候可以选择Et3N来作为此反应的缚酸剂.

接下来用PCC对苷元进行了氧化，PCC是吡啶和CrO3在盐酸溶液中的络合盐，具有中等强度的氧化性能，有制作简单，处理方便等优点，产率也较稳定.但它是铬盐，污染在所难免.在实验过程中尝试了多种氧化剂，如dess－martini氧化剂、琼斯氧化剂、DCC＋DMSO氧化等，其中dess－martini氧化剂也具有较好的效果，而且比起铬盐更加环保.根据产物生成时间和产率来判断，dess－martini氧化剂也是一种氧化性能相对较弱的氧化剂.

RCE－4水解后得到的苷元在1－位和3－位有两个羟基，但这两个羟基的反应活性有比较大的差别.在氯代过程中得到两种产物：1－位氯代和1，3－位双氯代.在氧化过程中也得到两种产物：1－位氧化和1，3－位双氧化.结合平常观察和实验结果发现，1－位羟基较3－位更加活波，反应时首先发生.3－位则没有那么容易发生反应，只有在1－位反应完全后3－位才进行反应.据此，也可以通过改变反应条件和调整反应时间来控制产物的产生，反应条件加剧或是延长时间则可以得到更多1，3－位双反应产物.

2.2 结构表征讨论

在1H－NMR中，RCE－4由于连有一个二糖，在高场低场都出现了较多子峰信号.水解后，低场众多质子峰信号消失，证明水解成功，得到RCE－4苷元.结合13C－NMR谱图和二维谱中归属了各个质子峰，δ4.36－4.42出现一个质子峰信号为 H－16，δ3.93－3.96和δ3.28－3.32的两个质子峰对应的是 Ha－26，Hb－26，δ4.17和δ3.84出现的两个质子峰信号为H－1和H－3，δ3.03出现两个质子峰信号较为扁平，结合其它谱图可知，为1－位和3－位两个羟基上的活波氢信号.δ0.75－2.06出现的众多氢信号、两个单峰甲基信号、两个双峰甲基信号，13C－NMR谱图中显示27个碳都表明苷元母体结构存在无误.氯代产物13CNMR谱图显示27个碳信号，δ0.77－2.55出现众多质子峰信号表明产物存在.H－16，Ha－26，Hb－26三个质子峰信号几乎不变，δ3.03的两个活波氢信号消失.1－位单氯代的H－1和H－3质子峰信号则出现在δ 4.91和δ4.67处，1，3－位双氯代的 H－1和 H－3质子峰信号则出现在δ4.71和δ4.46处.氧化产物在1HNMR，13C－NMR谱图中也与以上情况类似.H－16，Ha－26，Hb－26三个质子峰信号依然没有太多变化，H－1和H－3出现在δ4.17和δ3.84的两个氢信号消失，结合二维谱图确定δ4.48处出现一个氢信号为H－3，13C－NMR中在δ214.1处出现一个碳信号证明1－位羟基氧化成功.对双氧化产物来说，1H－NMR中H－1和 H－3 的 质 子 峰 信 号 消 失，13C－NMR 中 在δ207.2和δ203.2出现两个碳信号直接证明此为1，3－位双氧化产物.

2.3 化合物的生物活性分析

利用经典的MTT方法，对目标化合物进行了体外抗肿瘤活性的检测.培养的Caski细胞按1×105个／mL的密度种植于96孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱中培养12h，将化合物配制成6个浓度梯度（50、25、12.5、6.25、3.13、1.57μg／mL），加入到96孔培养板中，每个浓度梯度设5个复孔，并设置空白孔（含细胞的培养液＋MTT＋DMSO）、阳性药物孔（含细胞的培养液＋丝裂霉素＋MTT＋DMSO）及调零孔（培养液＋MTT＋DMSO）.继续培养24h、48h、72 h后，于每孔中加入20μL的 MTT试剂（5mg／mL）显色，继续培养4h，吸出孔内的培养液，于每孔中加入150μL的DMSO，震荡摇匀10min，使结晶物充分溶解.酶标仪490nm波长下测其OD值，并计算抑制率和IC50值.

表1 化合物对Caski细胞的IC50值

结果表明：RCE－4体外对Caski肿瘤细胞株具有较好的细胞毒活性，在水解掉糖链之后，IC50值变大，活性变差.在苷元进行氯代和氧化后的产物活性与苷元本身接近，表明经过改造后活性也并没有好转.这些说明糖链对该化合物的活性具有较大影响，也为以后的结构修饰指明方向：1）进行1－位糖基的修饰，如用苷元连接单糖、二糖和多糖，研究不同糖链对化合物活性的影响.2）进行3－位糖基修饰或是1，3－位都连接糖基，讨论1，3－位连接相同糖基时对不同连接部位对化合物活性的影响.3）可以在1－位设计类似糖基的链状化合物，模拟糖基，从而得到不同碳链对化合物活性的影响.

3 结 语

利用酸对RCE－4进行了水解，得到了苷元，继而在苷元上进行了一部分的修饰.利用本文这几种方法进行反应，反应体系相对较干净，操作简单，在不考虑污染和毒性的情况下，氯代利用吡啶做缚酸剂，氧化利用PCC可以得到较好的收率.在考虑污染和毒性的情况下，氯代可以选择三乙胺做缚酸剂，氧化也可以用dess－martin氧化剂，污染小，产率也相对可观.RCE－4体外对Caski肿瘤细胞株具有较好的细胞毒活性（IC50为3.71μM），水解掉糖链使其失去了强的肿瘤细胞毒性，但提示可以进行1－位糖基和3－位糖基的修饰.

［1］ 赵保胜，朱寅荻，等.中药重楼研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，11：267－269.

［2］ Xu Aijuan，Han Liping.The Research Progress of Rhizorna Anemarrhenae［J］.Jowmal of Chinese Medicinal Materials，2008，4（31）：624－726.

［3］ Yi－Xin X，Hai－Sheng，Hua－Qing L，et al.Three New Saponins from Tribulusterrest Ris［J］.Planta Med.2000，66（6）：545－550.

［4］ Akihito Y，Yoshihiro M，Yutaka.Steroidal Saponins from Dracaena Surculosa［J］.J Nat Prod，2000，63：1239－21243.

［5］ Sheng－Xiang Q，Xing－cong L，Yansan X，et al.Isolation and Characterization of Cytotoxic Saponin Chloromaloside A from Chlorophytum malayense［J］.Planta Med，2000，66（6）：587－590.

［6］ Xu Qiongming，Shu Zhan，He Wenjun，et al.Antitumoractivity of Pulsatillachinensis（Bunge）Regelsaponins in Human Liver Tumor 7402Cells in Vitro and in Vivo［J］.Phytomedicine，2012，19：293－300.

［7］ Laurence D，Juraj H，Rene L.Chromatographic Procedures for the Isolation of Plant Steroids［J］.J.Chromatogr.A，2001，935：105－123.

［8］ Ripperger H.Steroid alkaloid glycosides from Solanum robustum［J］.Pytochemistry，1995，39（6）：1475－1477.