南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的抑制作用

王爱玲 王海燕 覃慧林 冯天艳 贺海波 杨小姣 邓 为 汪鋆植

（1.三峡大学 生物与制药学院 ＆湖北省土家医药研究所，湖北 宜昌 443002；2.湖北省宜昌市中医医院 ＆三峡大学 中医临床医学院，湖北 宜昌 443002；3.神农架聚能药业有限公司，湖北 神农架 422400）

南赤瓟为葫芦科植物Thldianthanudiflora Hemsl.的根，又名野南瓜、毛土瓜、球子莲，四棍汝等，其性味苦，凉，具有清热解毒、理气活血、泻热祛瘀、消肿散结、止痢通乳的功效［1］，民间主要用于治疗痈肿、肠炎、痢疾、毒蛇咬伤、通乳及妇科疾病.在前期研究中，发现南赤瓟水提物和醇提物可显著诱导Hela和 Caski细胞凋亡［2－3］.本研究拟在此基础上通过裸鼠宫颈癌Caski移植瘤模型，观察南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的抑制作用，并在此基础上探寻其可能的机制，以期为其用于宫颈癌的临床治疗提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 南赤瓟醇提物的制备

南赤瓟醇提物的制备参见前期研究报道［3］.实验时将南赤瓟醇提物干浸膏，实验时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度.

1.2 实验细胞及动物

人宫颈癌Caski细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心提供；雌性BALB／c－nu裸鼠15只，4～6周龄，体重18～22g，由武汉大学动物中心提供，饲养于SPF级动物实验室，裸鼠适应环境1周后即进行成瘤实验.

1.3 药品及主要试剂

RPMI－1640，美国Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司；HEPES，胰蛋白酶，美国Amresco公司；Annexin V－FITC，晶美生物工程有限公司；Trizol，美国Invitrogen公司；反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit），日本 TaKaRa公司，Bcl－2、Bax、Caspase－9、Caspase－3和 GAPDH（引物序列见表1）、即用PCR扩增试剂盒（Tap DNA Polymerase），生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为市售分析纯.

表1 荧光定量PCR引物序列

1.4 方法

1.4.1 细胞培养和动物模型的建立

Caski细胞培养于含10%新生小牛血清、105U／L青霉素、100mg／L链霉素的 RPMI－1640培养基中，置于37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度条件下培养，待Caski细胞贴壁生长，取对数生长期细胞，制备单细胞悬液，调整密度至4×107个／mL，裸鼠于右侧后腿背部皮下注射0.3mL／只单细胞悬液，注射局部出现明显皮丘，一周内注射2次.待肿瘤长出后，每日测量肿瘤体积，待瘤体生长至大于100mm3时，进行实验.

1.4.2 实验分组

待瘤体生长至大于100mm3后，将裸鼠完全随机分为3组：模型组，南赤瓟醇提物组（200mg／kg）和南赤瓟醇提物组（400mg／kg），每组5只，每组灌胃给予相应的药物，每天1次，连续给药4周.

1.5 观察指标

1.5.1 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠一般情况的影响

每3d测量1次裸鼠体重、饮食量、饮水量，每天观察裸鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等.分组后第2d（d1）开始测量各组移植瘤的长度（L）和宽度（W），每3d测量1次，肿瘤体积（V）＝（L×W2）／2，以观测时间（d）作为横轴，瘤体积的均值（mm3）为纵轴绘制移植瘤生长曲线.

1.5.2 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠瘤重和抑瘤率的影响

停药后24h将裸鼠脱颈法处死，完整剥出瘤组织，观察各组瘤块情况及有无周围组织浸润，常规剖腹观察有无腹水及其它脏器转移，称瘤体重量，计算抑瘤率.抑瘤率＝［1－（治疗组瘤重／对照组瘤重）］×100%.

1.5.3 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响

取瘤组织约10mm3，用4℃的PBS清洗2次，用眼科剪反复剪碎组织块后，200目尼龙网过滤2次，制成单细胞悬液；取2×107细胞，用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，具体方法参见Annexin V－FITC试剂盒说明书.

1.5.4 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织形态学的影响

取瘤后，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色后，置于光镜下观察各组裸鼠移植瘤组织的形态学变化.

1.5.5 南赤瓟醇提物对肿瘤组织 Bcl－2、Bax、Caspase－3和Caspase－9mRNA表达的影响

用Trizol试剂提取移植瘤组织总RNA，具体方法遵照说明书进行，然后将提取的RNA反转录为cDNA；在RNase Free处理过的反应管中加入SYBR® Premix Ex TaqTM II（2X）12.5μL，PCR Forward Primer（10μM）1μL，PCR Reverse Primer（10μM）1 μL，DNA 模板2μL，灭菌蒸馏水8.5μL，最终反应体系为25μL.将样品放入实时定量PCR扩增仪中按95℃预变性30s、95℃变性5s、退火30s、72℃延伸20 s条件扩增30次.利用PCR仪汇出扩增曲线，进行结果分析.

1.6 统计学处理

所有实验数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS15.0软件进行统计分析，组间比较用One－Way ANOVA分析，以P＜0.05为差异有统计学意义的标准.

2 结 果

2.1 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠一般情况的影响

Caski细胞接种后第10d起，裸鼠右侧后腿背部出现黄豆大小的移植瘤，15只裸鼠全部成瘤，用药前各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异（P＞0.05）.用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治疗后，各组裸鼠的进食量、饮水、大小便均正常，精神状态良好，活动正常，反应敏捷，皮肤颜色如常，移植瘤组织未见破溃.

2.2 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤体积的影响

由图1可见，模型组的移植瘤生长迅速，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治疗后，肿瘤体积虽然继续增大，但生长速度明显变缓，从治疗后第7d开始，与模型组比较，具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），且随着治疗时间的延长，其疗效愈加明显.

图1 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤体积的影响（与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.3 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织形态学的影响

由表2可知，模型组瘤体积和瘤重明显增加，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治疗后，其瘤重明显降低，与模型组比较具有显著性差异（P＜0.01）；其抑瘤率随剂量的增加而逐渐增高，与模型组比较具有显著性差异（P＜0.01）.

表2 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠瘤重、抑瘤率和细胞凋亡的影响（x±s，n＝5）

2.4 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响

模型组瘤组织的细胞凋亡率比较低，用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治疗后，其肿瘤细胞凋亡明显增加，与模型组比较，具有显著性差异，且随着南赤瓟提取物剂量增加凋亡率提高（P＜0.01）（见表2）.

2.5 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织形态学的影响

图2 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织形态学的影响

由图2可见：模型组肿瘤细胞细胞核增大，核呈2个或多个，大小、形态不一，核仁清晰，染色质增多，核膜显著增厚；用南赤瓟醇提物治疗后，瘤细胞出现皱缩，细胞质密集，核染色质边集，可见细胞凋亡，并有坏死区域出现，而且随南赤瓟醇提物剂量的增加，凋亡细胞明显增多，坏死区域出现显著增大.

2.6 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织Bcl－2、Bax mRNA表达影响

如表3所示，模型组肿瘤组织中Bcl－2mRNA表达水平明显增加，Bax mRNA表达水平明显降低；用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治疗后，Bcl－2mRNA表达明显降低，Bax mRNA表达明显升高，Bcl－2／Bax的比值降低，与模型组比较具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），且随着南赤瓟醇提物剂量增加而增强.

表3 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织Bcl－2、Bax mRNA表达的影响（x±s，n＝5）

2.7 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织 Caspase－3、Caspase－9mRNA表达的影响

如表4所示，模型组肿瘤组织中Caspase－3、Caspase－9mRNA表达水平明显降低；用南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）治疗后，肿瘤组织中Caspase－3、Caspase－9mRNA表达水平明显升高，与模型组比较具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），且随着南赤瓟醇提物剂量增加而增强.

表4 南赤瓟醇提物对Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织Caspase－3、Caspase－9mRNA表达的影响（x±s，n＝5）

3 讨 论

宫颈癌是临床最常见的妇科恶性肿瘤，由于其恶性程度高，多易复发，而且死亡率高，使得当前已成为全球性的公共卫生问题［4］.据 WHO统计统计，全球每年新发宫颈癌病例有55.51万，其中我国就有13.15万，占新发病例28.8%［5－6］.尤其应该关注的是，当前我国宫颈癌的发病率不仅出现明显的上升趋势，而且呈现底年龄化.因而，在我国宫颈癌的防治任务显得尤为艰巨［3，7］.目前在宫颈癌的综合治疗中，除手术、放疗之外，化疗是防治该肿瘤的重要手段之一，但由于当前的一线化疗药物费用昂贵，加之毒副作用大，极大的增加了患者的负担和痛苦.因此，新型的高效、低毒的化疗药物亟待开发.近年来，许多少数民族地区流传使用的草药以毒性低、安全范围广、药源丰富越来越受到人们的关注，已成为肿瘤治疗领域的一大特色.南赤瓟作为土家族民间草药，主要用来治疗痈肿、肠炎、痢疾、毒蛇咬伤，通乳及妇科疾病.我们前期发现其水提物和醇提物可显著诱导Hela和Caski细胞凋亡［2－3］.本研究拟在此基础上通过裸鼠宫颈癌Caski移植瘤模型，观察南赤瓟醇提物对对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的抑制作用，并在此基础上探寻其可能的机制，为此我们设计了此实验.研究发现，南赤瓟醇提物（200和400mg／kg）可显著抑制瘤体组织中的肿瘤细胞增殖，且随南赤瓟醇提物剂量增加，其瘤体积、瘤重均明显减小，抑瘤率显著增大，与模型组比较具有显著差异（P＜0.05或P＜0.01）.细胞形态改变和细胞凋亡是评价抗肿瘤药物的重要依据，本实验通过HE染色和细胞凋亡检测发现，Caski细胞移植瘤裸鼠用南赤瓟醇提物治疗后，肿瘤组织的形态学也发生改变，出现肿瘤细胞凋亡及坏死；流式细胞仪检测发现，南赤瓟醇提物可显著诱导导肿瘤细胞凋亡，而且随着其剂量的增加其作用效果愈加明显.实验结果表明，南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的生长具有显著的抑制作用，该作用主要是通过诱导肿瘤细胞的凋亡来实现的.

总所周知，细胞凋亡是生物体细胞在正常生理或病理状态下所发生的一种自发的、程序化的死亡过程，通常情况下，该过程受到生物体信号网络的严密调控［8－9］.在总舵 的 调 控 因 素 中，Bcl－2 家 族 最 受 备 受关注，通常情况下，Bcl－2基因在细胞凋亡的上游发挥调控作用，它通过和Bax结合形成异源二聚体，来抑制Bax的促凋亡作用；当Bax表达升高时，由于Bax同源二聚体形成增多，使得细胞凋亡加速；反之，当Bcl－2表达升高时，会加速Bax同源二聚体解离，进而形成Bcl－2／Bax异源二聚体，发挥抑制细胞凋亡作用，因此Bcl－2／Bax的比值常常决定着细胞的存活或死亡［3］.本研究中，我们发现南赤瓟醇提物可显著地升高Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织中Bax mRNA表达，降低Bcl－2mRNA表达和Bcl－2与Bax的比值.实验结果表明，南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的细胞凋亡促进作用可能与其调节Bcl－2和Bax基因表达水平有关.

在细胞凋亡的调控通路中，除Bcl－2家族参与细胞凋亡外，细胞质中的Caspase蛋白激酶家族在这一过程扮演了重要角色［10］.总所周知，在凋亡过程中，Bcl－2家族在细胞凋亡的上游过程发挥作用，而Caspase蛋白激酶家族则在下游发挥作用，在这一过程中有多种促凋亡和抗凋亡的蛋白相互博弈来决定着细胞命运.比如，Bcl－2家族基因异常表达，使得Bcl－2／Bax比值降低，导致线粒体膜通透性增加，使细胞色素C从线粒体释放到胞浆中，与凋亡蛋白酶活化因子－1和Caspase－9的前体结合形成凋亡小体，来激活Caspase－9，再酶解Caspase－3前体，释放出C末端小肽片段，从而活化Caspase－3，然后瀑布式激活Caspase－2，Caspase6，Caspase8，Caspase10等蛋白激酶.最终激活脱氧核糖核酸酶，水解核酸和细胞骨架蛋白，导致细胞凋亡［3，11－12］.因此，激活 Caspase－9及Caspase－3是细胞凋亡的必经之路.本研究中，我们发现南赤瓟醇提物可显著升高Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织中Caspase－9及Caspase－3的mRNA表达水平，其实验结果与肿瘤组织形态学和细胞凋亡分析结果一致.

综上所述，南赤瓟醇提物可显著抑制裸鼠宫颈癌Caski移植瘤的生长，促进瘤体肿瘤细胞的凋亡，且呈明显的剂量依赖性，并初步证实其机制可能与上调Bax、Caspase－9、Caspase－3和下调 Bcl－2凋亡相关的基因表达有关..

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