牛奶中庆大霉素胶体金试纸条检测方法的研究

彭桂平邓红枚刘 平李 楠鲁晓雄聂雯莹*

牛奶中庆大霉素胶体金试纸条检测方法的研究

彭桂平①邓红枚①刘 平②③李 楠②③鲁晓雄②③聂雯莹*②③

（①湖南省桂阳县畜牧兽医水产局 424400 ②北京勤邦生物技术有限公司③北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心）

采用胶体金免疫层析法检测牛奶中庆大霉素残留。制备得到了庆大霉素半抗原，并与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原，用免疫原制备特异性单克隆抗体，建立了一种简单、快速和高通量的检测牛奶中庆大霉素残留量的胶体金免疫层析法。试纸条对牛奶样品的检测限为20μg/L，假阳性率为0，假阴性率为0，重复性较好，牛奶样品可直接检测，检测时间只需5min，适合在基层抽检、乳品企业质控、原料奶站现场大量筛查使用。

庆大霉素 胶体金免疫层析 快速检测试纸条 牛奶

庆大霉素（Gentamicin， GM）是由放线菌科小单孢子属产生的氨基糖苷类抗生素［1］，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌都具有显著的抗菌效果，作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。使用方法主要是添加庆大霉素混合于饲料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治疗奶牛乳房炎，两种给药方式都会造成药物在牛乳中残留。庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重［2-3］。许多国家和国际组织均明确规定了食品中该药物残留的最大残留限量。欧盟规定，牛奶中的最大残留量为100μg/kg。农业部235号公告规定了庆大霉素在牛奶中的最大残留限量为200μg/kg。目前，庆大霉素的检测方法主要有微生物法［4］，仪器分析法［5-6］，免疫分析法［7-9］。微生物法检测时间长；仪器分析法样品前处理复杂、检测时间长、仪器昂贵，适用于样品在实验室中的分析检测；免疫分析法具有灵敏、快速、检测成本低等特点。本研究建立了牛奶中庆大霉素胶体金试纸条检测方法，方法灵敏度高、操作简单、检测快速、不需要仪器设备，适合在基层抽检、乳品企业质控、原料奶站现场大量筛查使用。

1　材料与方法

1.1试验材料

牛奶样品购自超市；庆大霉素标准品购自美国Sigma公司；结合物释放垫、PVC背板购自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜、吸收垫、样品垫购自普利来基因技术公司；庆大霉素抗原、庆大霉素单克隆抗体均为自制；羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2仪器

1.3方法

1.3.1庆大霉素半抗原合成 取1.0g庆大霉素加入到N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再加入0.8g重铬酸吡啶，搅拌，加入0.3ml乙酸，60℃油浴加热搅拌6h，待反应完全，停止反应并蒸干，加水和乙酸乙酯萃取，干燥，乙醇重结晶，得到产物1.取产物1加甲醇溶解，再加0.3gK2CO3，搅拌，向其中加入0.4g甲酸苯肼，在室温下搅拌8h，待有沉淀物析出离心分离，用乙醇洗涤，再加乙酸乙酯重结晶，得到庆大霉素半抗原。合成路线如图1所示：

图1　庆大霉素半抗原合成路线

1.3.2免疫原的制备 取20mg庆大霉素半抗原，溶解于1mlN，N-二甲基甲酰胺中，取25mg二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺用0.1ml水充分溶解后加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白（BSA）50mg，使之充分溶解在pH7.2、3.8ml的磷酸盐缓冲液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到HRP溶液中，并于室温下搅拌24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到庆大霉素免疫原；分装，于-20℃保存备用。

1.3.3包被原的制备 将50mg BSA溶液替换为40ml卵清白蛋白（OVA），其余方法同1.3.2。

1.3.4单克隆抗体的制备 将免疫原分别注入到6-8周龄BALB/C磁性小鼠Balb/c小鼠体内，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔两周取相同剂量免疫原加弗氏不完全佐剂加强免疫1次，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。第三次免疫后一周眶下窦采血，然后按照常规方法分离血清；以未免疫的小鼠血清为阴性对照；间接竞争ELISA方法测定抗体效价及抑制情况，选取血清效价高及特性好的小鼠进行加强免疫，72h后做融合。取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法进行克隆，分别得到分泌苯乙醇胺A单克隆抗体的苯乙醇胺A单克隆杂交瘤细胞株。将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，提纯后即可得到单克隆抗体。

1.3.5庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备 胶体金溶液100ml，用0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入15μg抗体量的标准向胶体金溶液中加入庆大霉素单克隆抗体，搅拌30min，加入10%牛血清白蛋白使其在胶体金溶液中的终浓度为1%，静置30min，12000r/min，4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液（BSA0.4%（体积百分含量）、吐温-80 0.1%（质量百分含量）、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PBS））洗涤两次，用10ml的复溶缓冲液将沉淀重悬，放置于4℃备用。

1.3.6庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物的冻干 加入50μl庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，速冻4h后，再真空干燥，取出，即得到冻干的庆大霉素单克隆抗体-胶体金标记物，密封保存，金标抗体的冻干量为1μg/ml。

至于综合材料艺术在中国的状况，值得一提的是1985年11月18日，中国美术馆举办的美国艺术家罗伯特.劳申伯格(Robert Rauschenberg)个人艺术展。这个展览对中国艺术家的影响极大，很多艺术家由此开始接触综合材料在艺术中的运用，各种冲破学院风格的作品纷纷出现。虽然是一种边缘化的野蛮生长，却具有十足的生命力。

1.3.7样品吸收垫的制备 样品吸收垫置于含0.5%（体积百分含量）BSA、pH为7.2的0.1mol/L的PBS中浸泡3min，烘干备用。

1.3.8庆大霉素包被原和羊抗鼠抗抗体的包被 用pH为7.2的0.01mol/L PBS将庆大霉素抗原稀释至浓度为1.5mg/L，用喷膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线T线上；用pH为7.2、0.01mol/L PBS将羊抗鼠抗抗体稀释，用喷膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线C线上，包被量为1.2μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃下干燥2h，备用。

图2　庆大霉素残留检测试纸条平面结构图

1.3.9试纸条组装 将样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在PVC底板6上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连接，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸条样品吸收垫上黏贴保护膜，保护膜上印有MAX标记线。

2　结果与分析

2.1庆大霉素半抗原的鉴定

庆大霉素是小分子药物，没有免疫原性，不能刺激机体产生针对庆大霉素抗原的特异性抗体［10］，庆大霉素半抗原是用重铬酸吡啶将庆大霉素原药中的醇羟基氧化成酮基，得到单酮基庆大霉素，然后单酮基庆大霉素与对甲酸苯肼进行缩合反应，得到带有羧基的庆大霉素半抗原产物。再与载体蛋白偶联，得到免疫原。在免疫动物时，使免疫原的决定簇尽可能暴露在动物免疫系统中，从而提高抗体的灵敏度和特异性。

2.2庆大霉素免疫原和包被原的鉴定

通过紫外扫描法鉴定庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联是否成功。用纯水稀释庆大霉素半抗原、BSA、OVA和两种蛋白与庆大霉素的结合物，用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到紫外吸收光谱图。如图4～8所示。

图4　庆大霉素半抗原紫外光谱鉴定图

图5　牛血清白蛋白紫外光谱鉴定图

图6　卵清白蛋白的紫外光谱鉴定图

图7　庆大霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物紫外光谱鉴定图

图8　庆大霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物的紫外光谱鉴定图

根据公式K=A/CL分别计算出庆大霉素、BSA、OVA的摩尔消光系数。在载体蛋白和庆大霉素半抗原的最大波长处检测偶联物的吸光度值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比：Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KGM 264-A偶264×KGM 280）。蛋白含量的测定：将偶联物稀释到适当倍数后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度：蛋白质（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260。根据庆大霉素半抗原、载体蛋白、偶联物在特定波长下的摩尔吸光系数估算半抗原与载体蛋白的结合比分别为13：1和15：1；免疫原的蛋白含量为9.6mg/ml，包被原的蛋白含量为7.4mg/ml，偶联效果较好。

2.3庆大霉素包被原和羊抗鼠抗抗体最适包被浓度

庆大霉素包被原和羊抗鼠抗抗体用0.02mol/L pH7.2的PBS分别配制浓度为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml和0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/ml，用喷膜仪将上述浓度的庆大霉素包被原和羊抗鼠抗抗体包被于硝酸纤维素膜上，分别制备得到检测线T线和C线，并于金标抗体装配成试纸条，取空白牛奶样品用试纸条进行检测，检测结果如表1。结果显示，采用1mg/ml的庆大霉素包被原和0.2mg/ml的羊抗鼠抗抗体的浓度即可满足灵敏度要求。增加羊抗鼠抗抗体的浓度不提高检测灵敏度。

表1　阴性牛奶样品庆大霉素包被原和羊抗鼠抗抗体不同包被浓度的检测结果 （mg/ml）

2.4金标抗体的最适标记浓度

将庆大霉素单克隆抗体用pH7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液逐级稀释为5～40μg/ml，各取0.1ml按顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后在上述试管内分别加入0.1ml、10％氯化钠溶液，混匀，静置2h后观察结果，结果见表2，图4。

表2　胶体金标记抗体最适量的测定 （ml、μg）

1～4管由于加入的抗体蛋白量不足，为达到稳定胶体金的最适抗体量，均呈现出由红变蓝的聚沉现象，从第5管开始胶体金溶液颜色基本一致，如图9所示，当抗体量达到一定数值后，对应的吸光光度值的变化趋于稳定，这是由于加入的抗体量达到或超过了稳定胶体金的最适抗体量所致。通过图9可知，当抗体量等于和大于15μg/ml时，对应的吸光光度值的变化趋于稳定，故庆大霉素单克隆抗体最适用量15μg/ml。

图9　胶体金与标记蛋白比例试验结果

2.5试纸条检测限的确定

向空白牛奶样品中添加庆大霉素标准品至终浓度分别为10μg/L、20μg/L和40μg/L，用试纸条进行检测，每个样品进行5次重复，5min后观察结果，验证试纸条的最低检测限，根据图5判定结果。当牛奶样品中庆大霉素浓度为10μg/L时，试纸条T线和C线均显色，检测结果为阴性（-）；当牛奶中庆大霉素的添加浓度为20μg/L和40μg/L时，试纸条T线不显色，C线显色，检测结果为阳性（+），可以得出试纸条的检测限为20μg/L。结果如表3所示。

表3　庆大霉素残留检测试纸条检测限的测定

2.6重复性的测定

取试纸条检测阴性牛奶样品和庆大霉素浓度为20μg/L的阳性牛奶样品各5份，每个样品重复测定5次，观察检测结果确定试纸条重复性。试纸条检测结果显示，对庆大霉素阴性样品检测，结果均为阴性，对阳性样品检测，结果均为阳性。试纸条检测未出现错误结果，因此试纸条的假阳性率为0，假阴性率为0，试纸条的重复性较好。

2.7特异性的测定

表4　不同浓度药物间的交叉反应和特异性

将庆大霉素、链霉素、双氢链霉素、新霉素标准品溶于pH7.1、0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，至终浓度分别为0、20、40、100、200μg/L，用试纸条检测，结果见表4。表中结果显示庆大霉素与上述药物之间均无交叉反应，特异性强。

3　结论

庆大霉素半抗原合成，是用重铬酸吡啶将庆大霉素原药中的醇羟基氧化成酮基，得到单酮基庆大霉素，然后单酮基庆大霉素与对甲酸苯肼进行缩合反应，得到带有羧基的庆大霉素半抗原产物，使得抗原决定簇尽可能暴露于动物的免疫系统中，提高了制备高灵敏度庆大霉素特异性抗体的可能性；利用紫外分光光度法测定庆大霉素半抗原、免疫原和包被原的吸光度值，计算偶联比和蛋白含量，可知偶联效果较好；通过对庆大霉素包被原质量浓度和羊抗鼠抗抗体质量浓度的筛选，得到1mg/ml的庆大霉素包被原和0.2mg/ml的羊抗鼠抗抗体的浓度即可满足灵敏度要求；庆大霉素单克隆抗体最适用量15μg/ml；试纸条的检测限为20μg/L；试纸条的假阳性率为0，假阴性率为0，重复性较好；试纸条对庆大霉素具有较强的特异性。本研究建立的牛奶中庆大霉素试纸条检测方法适合在基层抽检、乳品企业质控、原料奶站现场大量筛查使用。

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S859.79+6

A

1007-1733（2015）06-0003-04

国家科技支撑计划课题（2012BAF14B02）