siRNA干扰SIAH对细胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影响*

徐　晶　张馨芝　张永进　李秀明　王　敏　蔡增林　李小民

siRNA干扰SIAH对细胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影响*

徐晶①张馨芝①张永进①李秀明①王敏①蔡增林①李小民①

目的：研究siRNA干扰SIAH基因对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞α-synuclein泛素化、降解通路的影响。方法：用荧光标记的siRNA-FAM转染SH-SY5Y细胞后，专业设计合成3条针对SIAH的siRNA，Western Blot检测蛋白水平SIAH表达的变化，筛选出其中最高效的1条siRNA，用CCK-8法检测该siRNASIAH干扰SH-SY5Y细胞活性；流式细胞技术检测该siRNA-SIAH干扰SH-SY5Y细胞凋亡的影响；Western Blot检测α-synuclein、LC3、E1、P53蛋白水平表达的变化；qRT-PCR检测SIAH、α-synuclein、LC3、E1 mRNA水平表达的变化；免疫共聚焦分别检测SIAH、α-synuclein、LC3共定位情况。结果：3条siRNA均成功转染SH-SY5Y细胞，流式细胞术检测siRNA转染SH-SY5Y细胞转染率89%，Western结果显示其中siRNA-2#使细胞中SIAH蛋白表达明显降低，选取该序列进行研究。CCK-8法结果显示该siRNA干扰SIAH后对SH-SY5Y细胞活增高，流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰SIAH可抑制SH-SY5Y细胞的凋亡，与空白对照组、阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。通过Western Blot检测siRNA-2#组的α-synuclein、LC3、P53蛋白水平，与空白对照组、阴性对照组比较均明显降低，E1蛋白水平增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。通过qRT-PCR检测siRNA-2#组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ mRNA水平与空白对照组、阴性对照组比较均明显降低，而E1的mRNA水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：应用siRNA干扰SIAH基因，通过促进泛素-蛋白酶体系统作用减少SH-SY5Y中α-synuclein聚集，SIAH基因有可能成为帕金森病治疗中的一个新靶点。

帕金森病； E3泛素连接酶； α-synuclein； 泛素化蛋白酶体

First-author's address：Affiliated L ianyungang Hospital of X uzhou Medical College，L ianyungang 222002，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.27.001

帕金森病（Parkinson's Dieaese，PD）是阿尔茨海默病后的第二大最常见的神经系统变性疾病，65岁以上的发病率约1%［1］。它的特点是黑质致密部及其他脑干区域多巴胺能神经元变性和丢失，其主要临床表现为静止性震颤，运动徐缓、强直、姿势不稳定以及其他各种运动和非运动功能［2-3］。不管家族性或散发的帕金森病，其主要病理学标志是以胞质内α-synuclei聚集物为主的路易小体形成［4］。E3泛素连接酶—SIAH （seven in absentia homolog）能够使α-synuclein中的赖氨酸单泛素化，并能够促进其聚集而发挥对细胞的毒性作用［5］。本研究采用siRNA技术干扰SH-SY5Y细胞的SIAH活性，从而抑制α-synuclein的单泛素化，阻止细胞的死亡，为PD的靶向治疗寻找有效的调控靶位，提供新的治疗方法。

1　材料与方法

1.1材料 SH-SY5Y细胞为苏州大学神经科学研究所惠赠，胎牛血清购自Hyclone有限公司，DMEM/ F12购自Gibco公司、LipofectamineTM2000购自上海Invitrogen公司，CellCountingKit-8（CCK-8）购自Dojindo公司，TRNzol试剂、逆转录试剂盒购自Takala公司，引物由英俊科技有限公司设计合成，蛋白上样缓冲液（5X）购自碧云天生物技术研究所，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Bioworde公司，Marker购自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 含血清浓度10%的DMEM/F12培养基培养SH-SY5Y细胞，细胞培养于6 cm细胞培养皿中。每2～3天用0.1%的胰酶消化将细胞传代，细胞换液时加入培养液3 mL/次，培养皿放置于温度37 ℃、二氧化碳（CO2）浓度为5%的孵箱中培养。

1.2.2SIAHsiRNA的设计合成 由苏州吉凯公司设计合成SIAH基因的3条siRNA，siRNA1、siRNA2和siRNA3。序列分别为siRNA1序列：5'-GCUCACAUGUUGUCCAACUTT-3'，其Anti-sense 为5'-AGUUGGACAACAUGUGAGCTT-3'；siRNA2序列：5'-CCUGGUGCUUCCUGUAAAUTT-3'，Antisense 为5'-AUUUACAGGAAGCACCAGGTT-3'；siRNA3序列为5'-GCGACUGUCUAGUCUUUGATT-3'，其Antisense为5'-UCAAAGACUAGACAGUCGCTT-3'。

1.2.3实验分组与细胞转染处理 实验分空白对照组（即未处理细胞组）、siRNA干扰组（siRNA-1#组、siRNA-2#组和siRNA-3#组）和阴性对照组，转染操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000说明书进行。

1.2.4CCK-8法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞活性 将细胞铺板96孔板，按照上述步骤进行转染，置于37 ℃、饱和湿度、5%的CO2条件下常规培养48 h后，内加入10 μL的CCK8/孔，再置于37 ℃孵育2 h。然后直接在酶联检测仪上450 nm波长处测A450值，以A450间接反映细胞存活数量。实验重复三次，据公式细胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%计算存活率，可推算SIAH-siRNA转染后48 h细胞的存活率。

1.2.5流式法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞凋亡 采用Annexin-V双染色检测早期凋亡细胞。用12孔板处理细胞，每孔接种细胞1.8×105个，各组设计复孔3个。转染同前，siRNA用量为2.5 pmoL/孔，脂质体为2.5 μL/孔。转染48 h后终止孵育，经消化处理收获各组细胞，细胞在预冷的PBS中清洗2次，重新离心，去除上清液，再用1×Annexin结合缓冲液混悬细胞，测定细胞密度，稀释至1×106个/mL。取100 μL，加入5 μL Annexin-V和1 μL的100 μg/mL操作液。室温孵育15 min，加入400 μL的1×Annexin结合缓冲液，轻轻混合，上机检测。

1.2.6Western Blot法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后蛋白表达水平 将SH-SY5Y细胞以1×105/mL种于6孔培养板中，每孔OPI-MEM培养基2 mL，按Lipofectamine2000说明书的条件转染，分3个组：实验分空白对照组（即未处理细胞组）、siRNA干扰组（siRNA-1#组、siRNA-2#组和siRNA-3#组）和阴性对照组，转染后6 h，换含10%血清的DMEM/F12新鲜培养液。转染72 h后，获取细胞，提取蛋白，蛋白定量，Western blot进行蛋白电泳，PVDF膜转膜1.5 h，脱脂牛奶封闭1 h，一抗4度孵育过夜SIAH （1∶100 SantaCruz America）、α-synuclein（1∶1000 Abcam USA）、LC3（1∶2000 Abcam USA）、E1 （1∶1000，Cell Signaling， USA）、P531∶1000 Abcam USA），用相应的HRP标记的二抗孵育室温2 h，ECL反应、压片、显影、定影，用ImageJ软件分析系统处理结果。

1.2.7qRT-PCR法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后mRNA表达水平 将SH-SY5Y细胞以5×104/mL种细胞于12孔培养板中，每孔OPIMEM培养基1 mL，按照Lipofectamine2000说明书的条件转染细胞，分3个组：实验分空白对照组（即未处理细胞组）、siRNA干扰组（siRNA-1#组、siRNA-2#组和siRNA-3#组）和阴性对照组，转染后6 h，换含10%血清的DMEM/F12新鲜培养液。转染后48 h，提RNA，反转录备cDNA，定量PCR仪上应用检测SIAH的表达。SIAH基因cDNA上游引物5'CTGTCGCCCCAAACTTACAT-3'，下游引物5'-CAAGGAGCCTTGCCACTTAC-3'，α-synuclein基因cDNA上游引物5'-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3'，下游引物5'-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3'；LC3基因cDNA上游引物5'-GAGTGGAAGATGTCCGGCTC-3'，下游引物5'-CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG-3'；E1基因cDNA上游引物5'-CCCTACATGACCAAGGCACT-3'，下游引物5'-CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG-3'；建立Q-PCR反应体系，每个样品扩目的基因和内参各3个重复。

1.2.8免疫共聚焦法观察SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 将SHSY5Y细胞以1×105/mL种于共聚焦培养皿中，转染方法同前，转染24 h后PBS冲洗干净，用4%多聚甲醛固定15 min，弃之，用pbs冲洗10 min×3遍。Trion-X-100打孔20 min，PBS冲洗10 min×3遍。5% 的BSA封闭1 h（37 ℃培箱，BSA用PBS配制），PBS 洗10 min×3遍。一抗孵育4度过夜SIAH（1∶100 SantaCruz America）、α-synuclein（1∶100 Abcam USA）、LC3（1∶200 Abcam USA），回收一抗，PBS洗10 min ×3遍，二抗孵育37℃ 2 h，PBS洗10 min×3遍，DAPI染10 min，PBS10 min×3遍，用蔡司共聚焦显微镜观察其定位情况。

1.3统计学处理 使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用（x-±s）表示，多组间比较使用单向方差分析（ANOVA，LSD），以P＜0.05为差异有统计学意义，PCR结果利用2-ΔΔCt法统计数据。

2　结果

2.1流式测转染率用FAM转染SH-SY5Y细胞6h后，用流式测转染率，其转染率可达89%。

2.2siRNA干扰SIAH对SH-SY5Y细胞SIAH蛋白表达的抑制 转染不同siRNA序列对SIAH蛋白表达的影响转染72 h后SIAH蛋白western blot电泳图，用Image J分析条带灰度值，并用β-actin做标准化，转染siRNA-1#组、siRNA-2#组、siRNA-3#序列后，转染siRNA-2#组后SIAH蛋白表达低于阴性对照组和空白对照组，即筛选siRNA-2#组进行如下研究。

2.3CCK-8法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞活性 CCK-8法检测转染siRNA-2#序列后与空白对照组和阴性对照组细胞活性相比，转染SIAH-siRNA 48 h后SH-SY5Y细胞活性比空白对照组、阴性对照组均有显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而空白对照组与阴性对照组之间变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1　SIAH-siRNA对SH-SY5Y细胞活力改变

2.4流式法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后细胞凋亡 流式法检测转染siRNA-2#序列后与正常细胞组和阴性对照组细胞凋亡率相比，转染SIAH-siRNA 24 h后SH-SY5Y细胞凋亡率比空白对照组、阴性对照组均有显著减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），而空白对照组与阴性对照组之间变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

图2　SIAH-siRNA对SH-SY5Y细胞凋亡改变

2.5Western Blot法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA后蛋白表达水平 与空白对照组相比，siRNA-2#组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降（t=2.931、3.307、5.506、3.326，P=0.0408、0.0297、0.0053、0.0292，），E1表达升高（t=3.480，P=0.0254）；与阴性对照组相比较，siRNA-SIAH组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降（t=5.178、4.851、5.941、4.400，P=0.0066、0.0083、0.0040、0.0117），E1表达升高（t=3.765，P=0.0197），见图3～7。

图3　SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后SIAH改变

图4　SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后LC3-Ⅱ改变

图5　SIAH1-siRNA 干扰SH-SY5Y细胞后α-synuclein改变

图6　SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后P53改变

图7　SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后E1改变

2.6qRT-PCR法测SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA 后mRNA表达水平 siRNA-SIAH组与空白对照组相比，SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降（t=11.04、16.70、12.98，P＜0.05），E1表达升高（t=8.739，P=0.0128）；与阴性对照组相比较，siRNASIAH组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降（t=6.066、16.58、4.043，P=0.0009、0.0036、0.0040），E1表达升高（t=9.170，P=0.0117），见图8。

图8　SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后mRNA水平改变

2.7免疫共聚焦法观察SH-SY5Y细胞转染SIAH-siRNA 后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 将SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，SIAH与α-synuclein的信号强度减弱，且SIAH与α-synuclein失去共定位，表明干扰SIAH基因能使α-synuclein聚集减少；将SIAH-siRNA干扰SH-SY5Y细胞后，LC3-Ⅱ与α-synuclein的信号强度减弱，表明干扰SIAH基因，导致自噬溶酶体成熟障碍。

3　讨论

帕金森病的主要病理学标志为黑质致密部神经体内Lewy小体，异常的α-synuclein聚集是Lewy小体的重要组分，因此α-synuclein聚集是帕金森发生、发展的一个中心环节［6］。α-synuclein有不规则聚集体、可溶性寡聚体或者类似小纤维三种主要存在形式，而这三个种类都有潜在的神经毒性，多数资料认为可溶性寡聚体表现出更大的细胞毒性而导致神经元丧失［7］。在正常神经元内，α-synuclein的生成与降解之间保持着动态平衡［8］。泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶体途径（Autophagy-lysosome pathway，ALP）是机体正常修复或者清除异常蛋白的最主要两种路径。蛋白酶体是一桶状多蛋白复合体，主要降解短寿的细胞核与细胞质蛋白，然而底物需要展开并通过蛋白酶体圆柱体狭窄的孔隙，这阻碍了低聚物和聚集蛋白的清除［9-10］。自噬是在溶酶体内清除细胞内变构和错误折叠的易聚集蛋白，这些蛋白多聚体对神经元有毒性并最终导致神经元的死亡，而自噬功能障碍可能是这些蛋白在受损神经元内积聚的主要原因［8］。研究表明，自噬途径主要降解不可溶性聚集蛋白，而UPS可以降解可溶性α-synuclein［11-12］。蛋白酶体通路可以清除经多聚泛素化后的α-synuclein，体内和体外实验研究表明，E3泛素连接酶—SIAH（Seven in absentia homolog）能够使α-synuclein 中的赖氨酸泛素化，并能够促进其聚集而对细胞产生毒性作用［13］。而SIAH所介导的α-synuclein单泛素化形成的聚集体只能通过自噬途径降解，因此笔者猜测可以通过干扰SIAH功能而减少α-synuclein的聚集及Lewy的形成，为PD的治疗提供新的方案。

目前笔者实验研究结果表明：将siRNA-SIAH转染细胞后，细胞活性增加，细胞凋亡率减少，可能是SIAH-1蛋白水平下降，P53蛋白水平受抑制，使P53诱导的细胞凋亡减少，这与文献［14］报道结果是一致的。siRNA-SIAH转染SH-SY5Y细胞后，SIAH的蛋白水平及mRNA水平均明显降低，SIAH能使α-synuclein单泛素化并促进其聚集从而产生多巴胺神经元细胞毒性［5］。实验结果表明：抑制SIAH后，蛋白水平上单泛素化α-synuclei降低，mRNA水平也证实这一点，免疫荧光共聚焦显微镜可明显观察到α-synuclei的含量减少。因此笔者认为，抑制SIAH活性，可以抑制α-synuclein单泛素化及其聚集。干扰SIAH后，自噬泡标记物LC3-Ⅱ在蛋白水平及mRNA水平上均减少，免疫荧光共聚焦显微镜也证实了这一点。因此，干扰SIAH活性，可能引起自噬活性减低。然而，干扰SIAH后，E1的表达在蛋白水平及mRNA水平上都增加，使UPS通路活性增加。SIAH介导的α-synuclein单泛素化的聚集及多巴胺神经元内形成聚集物［15］。所以，笔者认为，抑制SIAH的活性，能抑制α-synuclein的单泛素化及其聚集，使得单体水平增加，这些单体通过UPS通路而不是自噬通路降解。

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Effect of siRNA Interference SIAH on Cell Activity and α-synuclein Ubiquitin Degradation Pathway

/XU J ing，ZHANG Xin-zhi，ZHANG Yong-jin，etal.//Medical Innovation of China，2015，12（27）：001-005

Objective：To study the effect of siRNA-SIAH on α-synuclein autophagy and UPS degradation in SH-SY5Y.Method：After transfection of siRNA-FAM cells with fluorescent labeled SH-SY5Y， 3 siRNA were professional designed for SIAH，the protein level of SIAH expression was measured by Western Blot， one of the most efficient siRNA was selected.CCK-8 assay was used to detect the activity of siRNA-SIAH in SH-SY5Y cells. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of siRNA-SIAH in SH-SY5Y cells.Western Blot was used to detect the protein level expression ofα-synuclein，LC3，E1，and P53.qRT-PCR was used to detect the level of mRNA in SIAH，α-synuclein，LC3 and E1. Confocal microscopy was used to detect the positioning of SIAH，α-synuclein and LC3-Ⅱ.Result： 3 siRNA cells successfully transfected SH-SY5Y，the transfection efficiency was 89%. The Western results showed that the expression of SIAH was significantly decreased in siRNA-2# cells， then studied this sequence. CCK-8 assay showed that the SH-SY5Y cell activity increased after siRNA interference， and the flow cytometry results showed that siRNA could inhibit the apoptosis of SH-SY5Y cells， which was significantly different from the control group and the negative control group（P＜0.05）.With Western Blot method，the protein levels of α-synuclein， LC3 and P53 in siRNA-2# group were significantly lower and E1 was higher than that in control group and negative control group， the differences were statistically significant（P＜0.05）.With qRT-PCR method，the mRNA level of SIAH，α-synuclein and LC3-Ⅱ mRNA in siRNA-2# group were significantly lower and E1 was higher than that in control group and negative control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion： Using siRNA to interfere with SIAH gene， SIAH gene can be used as a new target in the treatment of Parkinson's disease by promoting the ubiquitin proteasome system to reduce SH-SY5Y in α-synuclein.

Parkinson's disease； Seven in absentia homolog（SIAH）； α-synuclein； Ubiquitin-proteasome system

江苏省自然基金面上项目（BK2011402）

①徐州医学院附属连云港医院 江苏 连云港 222002

李小民

（2015-06-03） （本文编辑：周亚杰）