建立豚鼠自体全厚皮片移植后色素沉着过程模型的研究

范勇杰, 戴海英, 吕 川, 朱 吉, 王宇翀, 赵 辉, 孙梦妍, 武 铠, 薛春雨

建立豚鼠自体全厚皮片移植后色素沉着过程模型的研究

范勇杰, 戴海英, 吕 川, 朱 吉, 王宇翀, 赵 辉, 孙梦妍, 武 铠, 薛春雨

目的 通过豚鼠自体全厚皮片植皮后观察黑色素沉着情况，探究作为自体皮片移植术后色素沉着模型的理想研究对象。方法 在3种不同颜色豚鼠行自体全厚皮片移植，观察黑色素在自体皮片中的沉着过程。结果 通过Masson-Fontana黑色素染色方法和image pro-plus 6.0软件分析,观察到黑色、棕黄色豚鼠术后明显的皮肤黑色素改变以及黑色素积分光密度/角质形成细胞面积比值在第1、2、3周与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；且黑色豚鼠术后4周与对照组比较，差异仍有统计学意义(P<0.05)；而白色豚鼠的植皮后黑色素与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 黑色、棕黄色豚鼠可作为研究自体全厚皮片移植后黑色素沉着的动物模型。

自体全厚皮片移植; 豚鼠; 色素沉着

自体全厚皮片移植是整形外科常见手术，能很好地建立皮肤屏障功能，尤其在关节处能改善患者肢体运动功能。然而在临床中我们发现，自体全厚皮片移植后植皮区有时会出现比正常的皮肤颜色更深的色素沉着[1]。目前研究皮肤黑色素的动物模型主要有斑马鱼、Smyth line鸡、C57BL小鼠和豚鼠[2-5]、皮肤美白化妆品药物试验。自2014年5～11月，我们通过对豚鼠行自体全厚皮片植皮后观察黑色素沉着情况，探究作为自体皮片移植术后色素沉着模型的理想研究对象。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器 Masson-Fontana黑色素染色液：A试剂(氨银溶液)，B试剂(天青石蓝溶液)，C试剂(中性红溶液)(由江苏南京森贝伽公司提供)。1%戊巴比妥钠，HE染色试剂(由第二军医大学附属长海医院中心实验室提供)，石蜡切片机,奥林巴斯PB840正置荧光显微镜(长海医院中心实验室提供)，佳能600D单反相机，EF 18-75镜头。

1.2 实验动物 普通健康成年雄性Hartly 豚鼠，白色、黑色、棕黄色各10只，体质量300～650 g，平均431.4 g(由第二军医大学动物实验中心提供)。

1.3 实验模型制备 将白色、黑色、棕黄色豚鼠按颜色分成3组，标记为甲组、乙组、丙组，每组10只。按体质量大小编号,12 h自然光并避免阳光直射，12 h避光饲养。术前禁食水 6～8 h，1%戊巴比妥钠按45 mg/kg腹腔注射麻醉后，机械脱毛，仰卧位固定豚鼠四肢，术区常规乙醇消毒，铺无菌巾单。于腹部脐上2.0 cm处距中线两侧2.0 cm处，各取约2.5 cm×2.5 cm全层皮肤，并将创面下的浅筋膜层做部分切除，克氏针在乙醇灯下加热，创面止血，所取供区皮片修剪掉皮下浅筋膜为全厚皮片，交换至对侧覆盖于创面， 1号编织线缝合，凡士林纱布覆盖术区，无菌纱布内置无菌棉花加压包扎，术后5 d拆包，7 d拆线。期间，2只白色豚鼠，1只黑色豚鼠，2只棕黄色豚鼠死亡，均退出实验。

1.4 实验方法 于术后1、2、3周，1、2、3个月，在植皮区距创缘10 mm无炎症反应处取5 mm×5 mm植皮皮片，对照皮片取非手术原供区附近全层皮肤。将所取标本行10%甲醛固定24 h，梯度脱水后石蜡包埋，切片按皮肤由表及里方向横切，厚度约5 μm；分成2份，一份行HE常规染色，一份行Masson-Fontana黑色素染色。镜下观察黑色素分布情况，并在400倍光学显微镜下观察并拍照。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，各组不同时间与本组自身均值对照，行配对t检验。P<0.05为有统计学意义。

2 观察结果

2.1 大体观察 术后3 d，内皮肤水肿明显，失去光泽，植皮区皮片颜色变暗；5 d后，植皮区表皮颜色发暗，稍变干燥；7 d左右，皮片成活，可见植皮区缝线四周表皮开始脱落；14 d时，大部分植皮区陈旧表皮已脱落干净，显露出植皮区新嫩表皮，但无明显毛发生长；3周左右，植皮区靠近中心区毛发丛样生长，并向创缘处延伸；4周左右植皮区大部分颜色大致恢复致术前；2、3个月，未见植皮区明显加深和减弱。

2.2 镜下观察 在光学显微镜下观察，白色豚鼠术后植皮区及对照皮片仅能在基底细胞层和毛囊中偶见黑色素颗粒，并未见明显增多趋势。棕黄色、黑色豚鼠植皮后1周时，较对照组黑色素减少，术后2周达到高峰，2周后，黑色素数量渐渐增多，4周时，与对照组皮片黑色素含量接近。

3 检测指标

每个标本切3张切片，每张片子随机拍照10张。要求对标本采用相同的处理手段，包括组织包埋大小、切片厚度，染色过程，并保持所有切片拍照环境一致；包括选择同一倍数下，统一光照、曝光时间，使空白对照处达到灰度值230左右。采用image pro-plus 6.0软件对拍摄照片进行分析，检测黑色素包括切片中表皮角质形成细胞、毛囊角质形成细胞、毛发中所含黑色素，同时检测含有黑色素组织的面积，包括表皮角质形成细胞、毛囊角质形成细胞、毛发等的面积(area of melanin-containing tissues, AMT)。计算黑色素积分光密度(integrated option density, IOD)/AMT。设计宏对每张照片做相同处理。

4 结果

黑色、棕黄色豚鼠黑色素IOD/AMT在植皮后第1、2、3周与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；且黑色豚鼠术后1个月与对照组比较，差异仍有统计学意义(P<0.05)；白色豚鼠术后植皮区黑色素IOD/AMT与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。使用GraphPadPrism6.01软件，将统计结果制成图表。

黑色豚鼠的皮肤黑色素含量较棕黄色、白色豚鼠多，依照图1～3可知，使用imagepro-plus6.0软件检测时，黑色素光密度/表皮细胞面积值较棕黄色和白色豚鼠高，在植皮后1周，棕黄色、黑色豚鼠黑色素IOD/AMT均降低，术后2周达到最低点，从第3周开始上升，棕黄色豚鼠于术后4周，达到术前水平，黑色豚鼠于术后8周，到达术前水平。白色豚鼠植皮后，皮肤颜色变化不大。棕黄色和黑色豚鼠符合植皮后早期创面修复时，角质形成细胞和黑色素细胞受到损伤及黑色素合成和转运速率下降的表现。2周时，植皮区表皮和毛发脱落接近完全，使皮肤中的黑色素IOD/AMT降至最低，3周左右毛发开始生长，黑色素IOD/AMT开始上升，在第4周时达到正常水平。白色豚鼠因为自身皮肤中黑色素含量较少，在植皮术中下降和上升趋势不明显，故黑色素IOD/AMT与对照组比较，差异无统计学意义。

5 讨论

皮肤色素主要受几方面影响：食物来源的胡萝卜素、皮肤的血红蛋白、含铁血黄素、黑色素等，其中黑色素在皮肤色素沉着中占最重要的作用，黑色素由黑色素细胞合成，在皮肤表皮中沉着呈现“核上帽”能有效避免紫外线对皮肤细胞核DNA的损伤。皮肤的颜色由黑色素颗粒的数量决定，而不是由黑色素细胞的数量决定[6]，自体皮片移植后出现的色素沉着主要为黑色素在表皮基底层的大量蓄积。对于动物模型豚鼠肤色的选择，目前文献报道无明确的标准，选用花色豚鼠作为研究对象为多[7-9]，在紫外线色素沉着诱导方面，一般选用棕黄色豚鼠[3]。1994年，李海洋等采用黑色豚鼠背部两侧自体皮片移植观察色素变化，忽视了皮肤色素受可见光尤其是紫外线的影响；秦瑶等[3]采用雌性豚鼠观察色素沉着，忽视了雌激素对皮肤色素的影响。我们采用雄性纯色豚鼠腹部植皮，一是可以确保全身色素均匀；二是确保排除雌激素对皮肤色素的影响；三是将腹部植皮区避免可见光照射，去除紫外线对皮肤色素的影响；四是可以避免因背部皮肤过厚，血运不足而导致植皮后存活困难。先前人们对皮肤色素沉着的黑色素含量判断主要是计数法，这种方法人为因素大，主观性较强。目前，采用计算机图片处理工具软件image pro-plus 6.0很好的克服了人为主观判断带来的误差，将黑色素观察进行量化，但是此法对拍照要求高，初学者不容易掌握。

图1 白色豚鼠植皮区不同时间点对黑色素积分光密度/含黑色素组织面积的影响 图2 棕黄色豚鼠植皮区不同时间点对黑色素积分光密度/含黑色素组织面积的影响 图3 黑色豚鼠植皮区不同时间点对黑色素积分光密度/含黑色素组织面积的影响

Fig 1 Ratio of melanin IOD/melanin-containing tissues at different time points of white guinea pigs skin transplantation. Fig 2 Ratio of melanin IOD/melanin-containing tissues at different time points of brown guinea pigs skin transplantation. Fig 3 Ratio of melanin IOD/melanin-containing tissues at different time points of black guinea pigs skin transplantation.

黑色或棕黄色豚鼠植皮后黑色素恢复沉着，大致需要1～2个月，黑色素平均光密度的增加必然是黑色素沉着的表现。植皮后皮片存活的过程也是创面修复的过程,其中包含了大量炎症因子和创面修复因子的共同作用[10-11]。另外，角质形成细胞的加速脱落，说明角质形成细胞在术后加速增殖，而角质形成细胞对黑色素沉着的作用亦非常重要[12-13]。如何抑制黑色素在自体皮片移植后皮肤的黑色素沉着是临床医师的棘手问题，建立一种研究黑色素沉着的动物模型，可以为临床研究皮肤黑色素沉着的机制提供研究平台。纯黑色或纯棕黄色豚鼠可作为理想的自体全厚皮片移植后黑色素沉着动物模型。

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Research about the model of pigmentation after autologous full-thickness skin transplantation on guinea pigs

FANYong-jie,DAIHai-ying,LYUChuan,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,ChanghaiHospitalofSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To observe the pigmentation after autologous full-thickness skin transplantation on guinea pigs, researching an ideal animal model of pigmentation. Methods Autologous full-skin transplantation was performed on 3 different color of guinea pigs and the processing of pigmentation was observed then. Results By Masson-Fontana stain and soft image pro-plus 6.0 analysis on the black and brown guinea pigs, the changes of skin melanin and the ratio of melanin IOD and keratinocyte area had the statistically significant differences at 1, 2 and 3 weeks after operation comparing with the control group (P<0.05)；furthermoretheblackguineapigsalsohadstatisticallysignificantdifferencesat4weeks(P<0.05),butthewhiteguineapigshadnostatisticallysignificantdifferencesallthetime. Conclusion Black and brown guinea pigs are ideal models to research the pigmentation process after full-thickness skin transplantation.

Autologous full-thickness transplantation ; Guinea pig; Pigmentation

200433 上海，第二军医大学附属长海医院 整形外科

范勇杰(1986-)，男，浙江湖州人，医师，硕士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.013

R

A

1673-7040(2015)04-0228-03

2014-12-06)