骨性关节炎患者膝关节软骨及软骨下骨中miR-214的表达

余晓明，袁雪凌，孟昊业，孙 振，尹合勇，郭全义，彭 江，汪爱媛，卢世璧解放军总医院 骨科研究所，北京 00853；南开大学，天津 30007

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种临床上常见的退行性疾病，主要表现为关节软骨及软骨下骨的退行性改变、关节疼痛、活动困难、骨赘形成等症状，好发于中老年人[1-2]。MicroRNAs(miRNAs，miR)是一个庞大的内源性、非编码核苷酸序列家族，长度21 ~ 25个核苷酸，主要在转录后信使RNA的功能上调控基因的表达[3-5]。近年来，越来越多的miRNAs被证明在骨科疾病中起着重要作用[6]。而miRNA-214被证明在骨质疏松的骨重塑过程中对破骨细胞的功能有调控作用[7]。为进一步研究miR-214的功能，本实验旨在探究其在骨关节炎发展进程中的表达情况，以便了解miR-214作为骨性关节炎治疗靶向标记物的潜在价值。

材料和方法

1 实验标本 实验用原发性膝关节骨性关节炎患者及截肢患者胫骨平台标本，由本院关节外科行人工全膝关节置换术治疗的30例OA患者及严重创伤需行截肢手术治疗的10例患者自愿捐赠。均排除肿瘤、类风湿关节炎、感染及激素治疗等因素。其中男性23例，女性17例，年龄31 ~ 82岁。患者术前均行双膝关节负重位X线检查，后依据Kellgren-Lawrence X线诊断标准将其分为Ⅰ级组(10例)、Ⅱ级组(10例)、Ⅲ级组(10例)、Ⅳ级组(10例)，进行实验检测。

2 RNA提取 将收集的胫骨平台分离软骨和软骨下骨，用陶瓷研钵分别将其在液氮下研碎。将分离的软骨及软骨下骨100 mg分别装入1.5 ml EP管中，用TRIzol提取组织中的RNA，样本经裂解、分层、RNA沉淀、洗涤和溶解后，使用分光光度计测定RNA浓度和纯度，确保后续试验准确度。

3 反转录合成cDNA 按照qPCR反转录试剂盒(SYBR Green ReverTra Ace qPCR RT Kit)说明书中要求，配置20μl反应体系，将测定浓度后的RNA样本加入反应体系进行反转录反应。反应在热循环仪上进行，配置反转录体系反应液的所有操作均在冰上进行。反转录反应体系成分：5×RT Buffer，4μl；RT Enzyme Mix，1μl；Primer Mix，1μl；RNA sample，2μl；Nuclear free water，加至20μl。反应条件 ：37℃15 min，95℃5 min。

4 实时荧光定量PCR 检测miR-214：按照qPCR扩增反应试剂盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus)说明书中要求，配置扩增反应混合液，并分别加入miR-214引物，U6为内参引物，最后加入反转录合成的cDNA，反应体系成分：SYBR Green RT-PCR Master Mix，10μl；Plus solution，2μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；cDNA，1μl；Nuclear free water，6μl。引物序列：miR-214，上游为GACAGCAGGCACAGACA，下游为GT GCAGGGTCCGAGG；U6上游为CTCGCTTCGGCAG CACA3，下游为AACGCTTCACGAATTTGCGT。扩增反应条件：95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃45 s，中间两步共40个循环。反应体系在实时荧光定量PCR机(Applied Biosystems Life Technologies，Foster City，CA，USA)中进行扩增反应。在结果分析中，miRNAs与U6的相对表达量用Delta Ct(ΔCt)表示，其最后表达倍数值用2-ΔΔCt值表示。

5 统计学分析 运用SPSS17.0统计学软件分析，各组间作比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-214在OA软骨组织中的表达水平 所有样本中均有miR-214表达，Ⅳ级组中miR-214的表达水平最高，各组表达水平呈逐渐上调趋势(图1)，各组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。OA发展严重程度与miR-214的表达水平呈正相关。

2 miR-214在OA软骨下骨中的表达水平 Ⅲ级组中miR-214的表达水平明显高于其他3组(P＜0.05)。软骨下骨中miR-214的表达水平差异不同于软骨中表达水平。见图2。

图 1 不同OA分级组软骨中miR-214的表达情况(aP＜0.05)Fig. 1 Expression level of miR-214 in different grade of OA cartilage(aP＜0.05)

图 2 不同OA分级组软骨下骨中miR-214的表达情况(aP＜0.05)Fig. 2 Expression level of miR-214 in different grade of OA subchondral bone (aP＜0.05)

讨 论

骨性关节炎主要以关节软骨退变、软骨下骨进行性改变、骨赘形成和滑膜炎症反应为主要特征，严重影响着患者的日常生活质量，而目前为止，最有效的治疗方法只是人工关节置换术[8-9]。虽然OA为中老年人最常见关节疾病，但发病机制复杂，至今尚未明确。如今，骨关节炎的发病机制已成为越来越多学者的研究热点[10]。探索骨关节炎的更加有效的治疗方法也成为分子生物领域的重点。

miRNAs主要起调控基因表达的作用，在关节疾病的发生发展中有很重要的作用[11]。miR-146a已被发现在OA软骨中早期高表达，晚期低表达，并且其表达减少是由白介素-1β导致[12]。miR-140亦被证明在OA软骨中被白介素-1β调控而表达降低，从而引起异常基因的表达，且miR-140还参与骨关节炎软骨损伤的修复及骨发育等过程，对软骨及骨的修复和发育具有关键作用[13-14]。基于miRNAs在骨和软骨中复杂的功能，miRNAs被认为是一种新型、高效能的调节OA中基因表达的方法[15]。

在miRNAs在骨和软骨组织中的调控功能的研究中，miR-214已被发现是一种新型的调控成骨转化的因子，抑制了小鼠成肌细胞的成骨分化功能[16]；而在成骨细胞中，miR-214通过靶向调控转录激活因子的表达，抑制成骨细胞的活性及基质矿化过程，从而促进骨质疏松的发生发展[7]。然而在骨性关节炎的机制研究中，miR-214的功能尚未明确。

通过本实验，作者证实了miR-214在OA软骨及软骨下骨中的异常表达，并且发现，在软骨中miR-214的表达水平随着OA严重程度的增加而逐渐升高，由此可见，miR-214可能参与OA进程中软骨损伤的过程，通过调控软骨相关退化基因而加速软骨的退化。而在OA的发展过程中，软骨和软骨下骨可以构成复合单元，在结构和功能上相互影响[2,17-19]。日常活动中，关节受到过度力学负荷而引发骨重塑，由早期的骨质吸收到晚期的骨质增生，再到最终的晚期骨质硬化和骨赘形成，整个OA病程中都存在骨重塑。而miR-214在软骨下骨中的异常表达，说明miR-214可能在骨重塑中起重要作用，而在K-L分级的Ⅲ级组中表达最高，证明随着骨质吸收的增加，miR-214的表达水平逐渐升高，而晚期骨质增生、骨赘形成，miR-214表达下降，由此表明，miR-214可能通过调控成破骨细胞活性而调节骨重塑过程。

综上所述，本实验证实miR-214在OA的发病过程中有重要作用，在软骨退变及软骨下骨改变中可能调控重要基因的表达，参与软骨退化及骨重塑。为下一步对miR-214在OA中的调控机制的研究提供理论基础。通过后期深入研究miR-214在软骨退变中的调控机制，结合其在骨中的调控功能，将为OA的临床诊断和治疗提供一种新型、有效的思路和方式。

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