重组人促红细胞生成素对压力超负荷大鼠左室肥厚的抑制作用

王东侠，刘金秋，夏云龙,谭茗月

(1.大连医科大学附属第一医院 心内科，辽宁 大连 116011； 2.中南大学湘雅二医院 心内科，湖南 长沙 410000)

重组人促红细胞生成素对压力超负荷大鼠左室肥厚的抑制作用

王东侠1，刘金秋1，夏云龙1,谭茗月2

(1.大连医科大学附属第一医院 心内科，辽宁 大连 116011； 2.中南大学湘雅二医院 心内科，湖南 长沙 410000)

目的探讨重组人促红细胞生成素(rhEPO)对压力超负荷大鼠心室肥厚的干预作用及机制。方法通过腹主动脉缩窄法建立大鼠压力超负荷诱导的心室肥厚模型后，将大鼠随机分为假手术组(Sham组)，模型组(AAC组)，rhEPO干预组(rhEPO组)，4周后处死大鼠，计算左室质量指数，心肌常规HE染色观察心室肌病理变化，分别用黄嘌啉氧化酶法、比色法检测心肌中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。用双夹心ELISA法测定心室组织的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，比较各组差异。结果4周后AAC组大鼠心肌显示明显的心肌肥厚，心室质量指数、MDA以及TNF-α的含量与Sham组大鼠比较均明显增高，而SOD的含量显著降低(P<0.01)。rhEPO干预后大鼠未显示明显的心肌肥厚，与AAC组大鼠相比，心室质量指数、MDA以及TNF-a的含量明显降低，SOD的含量则增高(P<0.01)。结论rhEPO可以抑制压力超负荷诱导的心室肥厚的形成，其部分机制可能与其抑制心肌中的过氧化反应及抗炎效应有关。

心室肥厚； 压力超负荷； 氧化应激； 炎症； 促红细胞生成素

[引用本文]王东侠，刘金秋，夏云龙,等. 重组人促红细胞生成素对压力超负荷大鼠左室肥厚的抑制作用[J].大连医科大学学报，2015,37(3)：227-231.

心室肥厚是高血压的主要并发症之一，无论对于总死亡率还是对于心血管事件的发病率和死亡率，心室肥厚都是一个独立的危险因素，但其发病机制还未完全阐明。大量体内体外实验证实炎性细胞因子、氧化应激在压力负荷引起的心肌肥厚过程中发挥了重要的作用。

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是由肾脏分泌的细胞因子，近年的研究发现，EPO受体广泛表达于人体内的非造血组织包括肝脏、大脑、子宫、血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等。它们与EPO结合激活某些信号途径，发挥抑制细胞凋亡、促进血管生成等多种与促造血作用无关的组织和细胞保护作用[1]。重组人促红细胞生成素(rhEPO)对心血管疾病的治疗作用已成为一个研究热点，但其对压力超负荷诱导的心室肥厚作用的研究甚少。本实验旨在探索rhEPO对压力超负荷诱导的心室肥厚的抑制作用及其可能机制。

1　材料和方法

1.1动物与材料

清洁级Wister大鼠28只(中南大学湘雅医学院动物实验室提供)，雌雄不拘，体重160～200 g。重组人促红细胞生成素rhEPO(益比奥,沈阳三药业公司)、SOD、MDA检测盒、考马斯亮蓝(南京建成生物公司提供)、大鼠TNF-αELLISA试剂盒(深圳晶美生物技术公司)。

1.2动物分组

大鼠28只随机分为3组，假手术组(Sham组)8只(皮下注射同等量生理盐水)，造模术后随机分为：模型组(AAC组)10只(皮下注射同等量生理盐水)；rhEPO组(rhEPO组)10只(皮下注射rhEPO)，其中rhEPO(1000 U/kg，1周3次)行皮下注射。

1.3压力超负荷大鼠模型的制作

Wister大鼠行4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，在剑突下腹正中切口，分层打开腹腔，在肾动脉分支以上钝性游离腹主动脉，将7号注射器针头平行置于腹主动脉上，再用4号手术丝线将腹主动脉和注射器一同结扎，然后缓慢将注射器撤出，关腹后分层缝合。使得大鼠腹主动脉直径缩窄为0.7 mm。Sham组开腹后将手术丝线穿过腹主动脉，除不缩窄腹主动脉以外，其他操作与AAC组完全相同。术后3天内给予青霉素腹腔注射(4000 U/kg)，以预防感染。

1.4给药方法

rhEPO组造模后给予皮下注射rhEPO(1000 U/kg，1周3次)。Sham组和AAC组大鼠术后正常饮食，并分别给予皮下注射等容量生理盐水。上述操作持续4周。

1.5左心室质量指数(LVMI)的计算

4周后大鼠禁食不禁水12 h，行4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，麻醉后称体重，然后开胸迅速取出心脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干，剪去心房及血管组织，沿室间隔分离左心室，包括室间隔，用电子天平称重。左心室质量除以体重得左心室质量指数(LVMI) 。将其它心肌组织标本置于液氮中保存。

1.6心肌组织形态学观察

取大鼠左心室游离壁心肌为标本，置于4%福尔马林固定心肌组织，然后作石蜡包埋。后以切片机切成5～10 μm厚的组织切片，贴于载玻片上，脱蜡后常规HE染色。光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化，摄片对比。

1.7心肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的检测

取大鼠左心室游离壁心肌为标本，用冰生理盐水冲洗，取约200 mg的左室心肌，剪碎加入2 mL冰生理盐水，在冰水浴中进行组织匀浆破碎，制成10%的心肌组织匀浆后3500 r/min离心15 min ，取上清液放入-20 ℃冰箱中待用。标本蛋白含量用考马斯亮蓝法检测，检测方法严格按操作说明进行。分别用比色法、硫代巴比妥酸法检测心肌中MDA和SOD的含量。根据试剂说明书的公式计算心肌中所含MDA含量。结果以每毫克蛋白心肌的含量表示。根据试剂说明书提供的公式计算心肌中SOD的含量。结果以每毫克蛋白心肌组织的活力单位表示。

1.8心肌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的检测

心室肌的取用及组织的匀浆同前，心肌组织的TNF-α含量用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测。

1.9统计学方法

实验数据用均数±SD表示。用统计学软件包SPSS12.0进行统计学分析，多样本均数间比较采用One-wayANOVA检验，组间比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1一般观察

28只大鼠中1只死于麻醉意外，2只分别在术后第1、2天因急性心力衰竭而死亡。1只死于术后感染。其中AAC组、rhEPO组分别死亡2只，其余均正常生存。

2.2左心室质量指数

AAC组大鼠左心室质量指数与Sham组比较增高了39.4%，差异有显著性意义(P<0.01)。用rhEPO干预后明显降低了大鼠左心室质量指数，与AAC组大鼠相比差异有显著性意义(P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠心脏的病理学指标Tab 1 LVW and LVWI of rats

2.3心肌病理变化

Sham组大鼠心肌无明显病理改变。AAC组大鼠的心室肌显示：心肌纤维增粗、断裂，细胞核增大，深染。间质有炎症细胞浸润；心肌小动静脉血管壁增厚，腔变狭窄；周围增多的胶原纤维包绕；局部心肌细胞缺血坏死后瘢痕形成。而rhEPO干预后大鼠的心室肌病理变化则较轻，主要表现为心肌细胞混浊肿胀，心肌纤维轻度的增粗，但无明显的紊乱、断裂，间质有少量的炎性细胞浸润，小血管管壁稍增厚。见图1。

图1　各组大鼠心肌组织病理变化(HE ×400)Fig 1 pathology of myocardial tissue in rats(HE ×400)

2.4心肌氧化产物MDA、抗氧化酶SOD的含量

AAC组大鼠心肌中氧化产物MDA含量与Sham组大鼠比较明显增高，抗氧化酶SOD含量则明显降低，差异有显著性意义(P<0.01)。而rhEPO干预后的大鼠，心肌氧化产物MDA含量比AAC组大鼠明显降低，抗氧化酶SOD含量则显著增高(P<0.01)。见表2。

2.5心肌TNF-α的含量

AAC组大鼠心肌炎症细胞因子TNF-α含量比Sham组大鼠明显增高，差异有显著性意义(P<0.01)。在rhEPO干预后大鼠的心肌炎症细胞因子TNF-α含量明显降低，与AAC组相比差异有显著性意义(P<0.01)。见表2。

表2　各组大鼠心肌MDA、SOD、TNF-α的含量Tab 2 Changes incontent of MDA,SOD and TNF-α of heart tissue of rats　±s)

3　讨　论

心室肥厚是压力超负荷的一种代偿，如压力负荷持续存在，最终会进展至心力衰竭，近年来大量的实验均已证实，氧化应激与心肌肥厚的发生、发展密切相关。本实验观察到大鼠心肌中氧化产物MDA的变化，AAC组大鼠与Sham组大鼠比较，含量明显增高，而AAC组大鼠抗氧化酶SOD的含量与Sham组大鼠比较则显著降低。表明AAC组大鼠在心肌肥厚形成同时伴有氧化产物的增加，而抗氧化性减弱，处于过氧化状态。结果提示氧化应激可能参与了压力超负荷大鼠心肌肥厚的形成。既往文献报道在多种高血压动物模型中均可观察到ROS活性增高，AngⅡ等神经体液因素所引起的多种病理变化与诱导ROS升高有关，而且ROS本身可能也是高血压的一个致病因素[2]。给予抗氧化治疗可减轻压力负荷诱导的心室肥厚[3]。体内实验证实AngⅡ诱导的心肌细胞肥大是由ROS所介导的，抗氧化治疗能够减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大[4]，而ROS在高血压的发生发展中发挥多种作用，包括细胞凋亡，细胞外基质的调节，NO活性的降低及各种蛋白激酶的激活[5]。

除此之外，本研究还观察到AAC组大鼠心肌中促炎症细胞因子TNF-α含量明显增加，并且从心肌组织形态上可以看到，AAC组的大鼠心肌中有大量的炎性细胞浸润，提示压力超负荷大鼠心肌肥厚形成时还伴有心肌中促炎症细胞因子的释放。即炎症可能参与了压力超负荷诱导的心室肥厚的形成。既往也有实验证实在压力负荷增加时，心肌中TNF-α含量也会增加，压力负荷增加时TNF-α足以引起心肌蛋白质合成增加[6]。过度表达还会导致心肌细胞肥大，收缩功能降低。TNF-α体外实验诱导心肌细胞肥大，促进细胞胚胎基因及蛋白的表达[7]。在转基因动物体内实验中也观察到相似的结果[8]。

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是具多功能效应的细胞因子，当机体受到缺血缺氧刺激时，EPO可以在缺氧诱导因子的作用下分泌增加。近年来的研究已经证明，不仅肾小管周间质细胞可以分泌EPO，而且体内很多器官和组织包括肝脏、大脑、子宫、血管内皮细胞、平滑肌细胞以及心肌细胞等都可以产生EPO和表达EPO受体，近几年大量动物模型实验证实[9-13]，它可以通过减少炎症、氧化应激对心肌的损伤，阻止内皮细胞和心肌细胞的凋亡，促进新生血管生成，从而在缺血再灌注损伤、心肌梗死、心力衰竭及一些非缺血性心肌病中发挥重要的心血管保护作用。而在本实验中观察到AAC组大鼠在经rhEPO干预后，左心室质量指数明显下降了，rhEPO组大鼠心肌切片的常规HE染色显示心肌组织形态病理变化明显减轻。上述结果均提示rhEPO对压力超负荷大鼠心室肥厚的形成有一定的抑制作用。

为了进一步探讨rhEPO抑制心室肥厚的作用机制，本研究观察了rhEPO对大鼠心肌中氧化产物MDA、抗氧化酶SOD和促炎症因子TNF-α的含量变化。结果发现rhEPO干预后，大鼠的心肌氧化产物MDA含量明显降低，而抗氧化酶SOD含量则明显增高。提示rhEPO可以降低压力超负荷大鼠氧化产物的生成，提高抗氧化酶的含量，从而发挥抗氧化作用，抑制氧化应激对心肌的损伤。由此分析可以得出，rhEPO对压力超负荷大鼠心室肥厚形成的抑制效应可能与其抗氧化作用有关。同时观察到rhEPO组大鼠心肌中促炎症细胞因子TNF-α的含量明显降低，从组织形态上也可看出，rhEPO干预后大鼠心肌间质中的炎症细胞明显减少。表明rhEPO还可以抑制压力超负荷大鼠心肌中促炎症细胞因子的释放，从而抑制压力超负荷大鼠心肌中的炎症反应对心肌的损伤。由此推论rhEPO通过抑制心肌中炎症细胞因子的释放，保护炎症对心肌的损伤，也可能是rhEPO发挥对心室肥厚的抑制作用的机制之一。此外研究表明ROS可以调控多种基因的表达，与细胞的凋亡、增殖及炎症相关[14]。在压力负荷大鼠心肌中ROS可能通过JNK信号通道增加组织化学趋化蛋白-1(MCP-1)的表达，进而调控促炎症因子的表达[15]。

本研究结果提示，rhEPO对压力超负荷大鼠的心室肥厚有抑制作用，其部分机制可能与rhEPO通过抑制氧化应激，进而抑制促炎症因子的释放，从而抑制氧化应激及炎症反应对心肌损伤的作用有关。

[1] Erbayraktar S,Yilmaz O,Gokmen N,et al.EPO is a multifunctional tissue-protective cytokine[J].Curr Hematol Rep,2003,2(6):465-470.

[2] Datla SR,Griendling KK.Reactive oxygen species,NADPH oxidases and hypertension[J].Hypertension,2010,56(3):325-330.

[3] Tsujimoto I,Hikoso S,Yamaguchi O,et al.The antioxidant edaravone attenuates pressure overload-induced left ventricular hypertrophy[J].Hypertension,2005,45(5):921-926.

[4] Li L,Zhang ZG,Lei H,et al.Angiotensin II reduces cardiac adipoR1 expression through AT1 receptor/ROS/ERK1/2/

c-Myc pathway[J].PLoS One,2013,8(1):e49915.

[5] Paravicini TM,Touyz RM.Redox signaling in hypertension[J].Cardiovasc Res,2006,71(2):247-258.

[6] Yakoyama T,Nakano M,Bednarczyk JL,et al.Tumor necrosis factor-α provokes a hypertrophic growth response in adult cardiacmyocytes[J].Circulation,1997,95(5):247-252.

[7] Wang GJ,Wang HX,Yao YS,et al.The role of Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinaseII and calcineurin in TNF-αinduced myocardial hypertrophy[J].Braz J Med Biol Res,2012,45(11):1045-1051.

[8] Rohini A,Agrawal N,Koyani CN.Molecular targets and regulators of cardiachpertrophy[J].Pharmacol Res,2010,61(4):269-280.

[9] Vilarinho KA,Oliveira PP,Saad MJ,et al.Erythropoietin protects the systolic function of neonatal heart against ischaemia/repurfusioninjury[J].Eur J Cardiothorac Surg,2013,43(1):156-162.

[10] Asiya PA,Raj PA,Shalini U,et al.Erythropoietin Protects Cardiomyocytes from Cell Death during Hypoxia/Reperfusion Injury through Activationof Survival Signaling Pathways[J]. PloS One,2014,9(9): e107453.

[11] Xue JY,Du GQ,Shi J,et al.Combined treatment with erythropoietin and granulocyte colony-stimulating factor enhances neovascularization and improves cardiac function after myocardial infarction[J].Chin Med J,2014,127(9):1677-1683.

[12] Chen X,Guo Z,Wang P,et al.Erythropoietin modulates imbalance of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 indoxorubicin-inducedcardiotoxicity[J].Heart Lung Circ,2014, 23(8):772-777.

[13] Gut N,Piecha G,Aldebssi F,et al.Erythropoietin combined with ACE inhibitor prevents heart remodeling in 5/6 nephrectomized rats independently of blood pressure and kiney function[J].Am J Nephrol, 2013,38(2):124-135.

[14] Lavrovsky Y,Chatterjee B,Clark RA,et al.Role of redox-regulated transcription factors in inflammation,aging and age-related diseases[J].Exp Gerontol,2000,35(5):521-532.

[15] Shang FJ,Wang JP,Liu XT,et al.Involvement of reactive oxygen species and JNK in increased expression of MCP-1 and infiltration of inflammatory cells in pressure-overloaded rat hearts[J].Mol Med R,2012,5(6):1491-1496.

Effect of rhEPO on left ventricular hypertrophy induced by pressure-overload

WANG Dong-xia1, LIU Jin-qiu1, XIA Yun-long1,TAN Ming-yue2

(1.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.DepartmentofCardiology,SecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410000,China)

Objective To investigate the effect of rhEPO on left ventricular hypertrophy induced by pressure-overload in rats. Methods The rat model were established by coarctation of abdominal aorta (AAC) in Wister rats. Rats were randomly allocated to three groups: Sham group, AAC group, rhEPO group. Rats in rhEPO group were injected rhEPO (1000 U/kg) subcutaneously for three times a week after operation. Rats in Sham group were given the same volume of physiological saline. All rats were killed after 4 weeks. Left ventricular mass index (LVMI) was calculated. Myocardial histological changes were observed with routine HE stain, and the level of SOD, MDA, TNF-α in myocardium were detected respectively. Results Compared with the sham group, there were significant cardiac hypertrophy, higher LVWI and level of MDA and TNF-α (P<0.01), while lower SOD level (P<0.01) in myocardium in rats of AAC group. However, compared with the AAC group, cardiac hypertrophy was significantly relieved in rhEPO group, as well as LVMI and the levels of MDA, TNF-α decreased, SOD level improved in myocardium (P<0.01). Conclusion RhEPO could attenuates left ventricular hypertrophy induced pressure overload via its function of antioxidation and anti-inflammatory.

ventricular hypertrophy; pressure overload; oxidative stress; inflammation; erythropoietin

论著10.11724/jdmu.2015.03.05

王东侠(1981-),女,河北张家口人,主治医师。E-mail:wangdx1980@aliyun.com

夏云龙，教授。E-mail: yunlong.xia@gmail.com

R3

A

1671-7295(2015)03-0227-05

2015-01-12；

2015-04-19)