健那绿B和铁苏木精对线粒体染色比较

吴艳

摘 要 就健那绿B和铁苏木精对线粒体的染色进行比较，指出两者区别。

关键词 健那绿B 铁苏木精 线粒体

中图分类号 Q-33

观察细胞中的线粒体和叶绿体是高中生物教材《分子与细胞》中的实验，在不同版本的教材中，对线粒体染色所用的试剂分别给的是“健那绿B”和“铁苏木精”。很多人对这是一种试剂还是两种不同试剂感到疑惑，尝试在百度中搜“健那绿”一词，结果在百度百科和百度文库中都显示这样的信息：健那绿中文别名“詹纳氏绿”、“双氮嗪绿”、“铁苏木精”。健那绿B到底是不是铁苏木精？如果不是，它们对线粒体染色有何区别？下面就健那绿B和铁苏木精对线粒体染色进行一些比较。

1 化学性质

1.1 健那绿B

就健那绿B名称：即双氮嗪绿，英文名为Janus green B，曾被翻译为詹纳斯绿B。

分子式：C30H31N6Cl（图1）。

健那绿B属于碱性染料，本身为棕色或深棕色结晶性粉末。由于本身带有N元素加上解离后呈正电荷，所以具有亲水性，溶水后溶液呈蓝色；微溶于醇。

1.2 苏木素、苏木精、铁苏木精

苏木素英文名：hematoxylin，也拼成haematoxylin。

分子式：C16H12O6（图2）。

苏木素是一种碱性染料，是从洋苏木中提取的一种染色剂，多为淡黄色或浅褐色的细粉末，略微溶于冷水及乙醚，溶于乙醇和热水，也溶于碱性氢氧化物、硼砂、甘油等。因为没有双键的醌式结构，苏木素本身没有染色能力，经氧化后会成为具有双键醌式结构的苏木精，同媒染剂一起使用，就具有很强的染色能力。

根据苏木精溶液所用媒染剂的不同，可分为铝苏木精（用的是三价铝盐）、铁苏木精（用的是三价铁盐）等不同种类。常用的两种铁苏木精溶液有Weigert氏溶液（使用氯化铁铵作为媒染剂）和Heidenhain氏溶液（使用硫酸铁铵作为媒染剂）。

2 染色原理及特点

2.1 健那绿B

健那绿B进入活细胞后，可在细胞中被解离而带有正电荷，与带有负电荷的线粒体内膜电性吸引，从而在线粒体内膜上积累。健那绿B在氧化状态下为有色，呈蓝绿色；在还原状态下为无色。因线粒体内膜具有细胞色素氧化酶，使健那绿B始终处于氧化状态而呈蓝绿色；细胞质中没有细胞色素氧化酶，健那绿B被还原而呈无色状态。

线粒体能在健那绿B染液中维持数小时活性，在这期间通过高倍显微镜可以观察到生活状态的线粒体形态和分布。并非任何染料都可用于活体染色，只有那些对细胞无毒或毒性很小的染料且要配成浓度很低的溶液才能用于活体染色。健那绿B是可以专一性对线粒体进行染色的活体染色剂。尽管如此，健那绿B也只能用于对动、植物体分离出来的活细胞或组织进行体外活体染色；如果将它直接注入动物体内，可以导致动物很快死亡。

健那绿B并非只能对活细胞的线粒体进行染色。对于已经死亡的细胞，细胞质呈氧化状态，在健那绿B染液的作用下，整个细胞会被染成蓝绿色；由于细菌细胞膜上存在氧化酶，故细菌细胞也可被染成蓝绿色。

2.2 铁苏木精

苏木素经氧化后形成具有发色功能的双键醌式结构的苏木精，再与媒染剂结合形成“媒染剂-染料-组织”的复合体，从而使材料显现颜色。媒染剂含盐种类不同，被染材料显示的颜色也不同：用铁盐做媒染剂，材料可呈现深蓝色至深褐色沉淀；用铝盐做媒染剂，材料通常显示为蓝白色。由三价铁盐作为媒染剂的铁苏木精，只能对固定液固定后的细胞和组织进行染色。

不同的铁苏木精溶液，染色对象有一定差异：用氯化铁铵作为媒染剂的Weigert氏铁苏木精是实验室使用的标准铁苏木精溶液，特别是在染色显示肌纤维时；用硫酸铁铵作为媒染剂的Heidenhain氏铁苏木精用于细胞学染色观察，比如用于细胞核及细胞质中线粒体的观察。

3 试剂配制

3.1 健那绿B配制

质量分数为1%的健那绿B染液配制：称取0.5 g健那绿溶解于50 mL生理盐水中，加温至30～40℃，使其充分溶解。现用现配。

3.2 铁苏木精配制

Weigert氏溶液配制：

A液：1 g苏木素、100 mL无水乙醇；

B液：4 mL质量分数为30%的无水氯化铁溶液、1 mL浓盐酸、100 mL蒸馏水。

在酒精中溶解苏木素，微热。在另一个容器中混合盐酸、氯化铁和蒸馏水。两种溶液都很稳定，可以放置6个星期不变质。染色前，把两溶液等量混合，得到深黑色混合液，即可染色。混合液可以保存1～2 d。

Heidenhain氏溶液配制：

染色剂：0.5 g苏木素、10 mL体积分数为95%的乙醇、90 mL蒸馏水；

媒染剂：25 g硫酸铁铵、100 mL蒸馏水。

把染色剂和媒染剂分开配制，放置4～5星期成熟。染色时再混合。

4 染色操作

4.1 使用健那绿B对线粒体染色

为了防止叶绿体对线粒体的掩盖和颜色的干扰，一般采用动物细胞或不含叶绿体的植物细胞进行线粒体观察。人的口腔上皮细胞易于取得，观察方便，在多种版本高中生物教材中被广泛应用。在载玻片上滴加1～3滴健那绿B染液，将获取的口腔上皮细胞浸入染液中，健那绿B可以很快进入动物细胞中，即刻就可以显微镜下观察。如果材料是不含叶绿体的植物细胞（例如洋葱内表皮细胞），染色过程和动物细胞相同，只是由于植物细胞有中胶层和细胞壁的存在，染色时间稍长（约10 min）。两种不同材料制作的临时装片，均可通过高倍镜观察着色后的线粒体。

4.2 使用铁苏木精对线粒体染色

铁苏木精染色的对象通常是动物组织如白鼠的小肠、胰腺、肝脏、肾脏等，需要用到多种试剂材料，操作步骤繁琐，耗时较长。近几年，不少专家尝试将实验操作步骤改良，效果较好，方法如下：将获取的新鲜动物组织块置入Regaud固定液固定2 d，然后放入质量分数为3%的重铬酸钾溶液中铬化5 d，经蒸馏水约4 h换洗后放入铁明矾溶液中媒染15 h，再置入质量分数为0.1%的苏木精染液中染色1 d。染色后的组织块在0.25%铁明矾水溶液中分色5～6 h，在缓慢的自来水中蓝化。然后用常规方法进行乙醇脱水、二甲苯透明、浸石蜡并进行石蜡包埋，切片3～4 μm厚度，烘干后经2道二甲苯脱蜡就可用中性树胶封片，制成切片标本。

5 实验观察

线粒体普遍存在动植物细胞中，虽然是在细胞中比较大的细胞器，但较叶绿体小很多，常见的有短棒转和圆球状，一般直径为0.5～1.0 μm，长1.5～3.0 μm，光镜下可见，但大小几乎接近光学显微镜的最低分辨率。

5.1 健那绿B染色后观察

高倍显微镜下看到的线粒体，呈蓝绿色的棒状和圆球状，随细胞质流动而运动；调节显微镜焦距，可观察到不同层面上线粒体的情况。

5.2 铁苏木精染色后观察

经铁苏木精染色后制成的动物组织切片标本，高倍显微镜下可清晰看到细胞质内线粒体颗粒和细胞核呈现深蓝色、底衬呈现浅灰色。

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