Cry1Ie蛋白的模拟胃肠液消化稳定性及热稳定性分析

李欣竹 耿丽丽 高继国 张杰

cry1Ie基因是由本实验室发现并克隆的具有自主知识产权的模式基因［8］，其编码蛋白只有81kD［9］，不同于大多数Cryl类蛋白的130kD。该基因的另一个特点是在Bt菌株中多数是沉默的，而在大肠杆菌中却能过表达［10］。Cry1Ie蛋白对小菜蛾（Plutella xylostella）、亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）及大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）均有很强杀虫活性［11］，并且该蛋白与商业化种植Bt作物中的Cry1Ab和Cry1Ac蛋白无交互抗性，具有巨大的应用价值［12］。中国农业科学院植物保护研究所与中国农业科学院作物科学研究所合作，将cry1Ie基因应用于抗虫玉米的培育［13，14］，目前已经进入生产性试验阶段。除了对亚洲玉米螟有显著的防治效果，对Cry1Ac抗性棉铃虫品系也具有杀虫活性［15］。

针对具有巨大应用价值和商业化前景的Cry1Ie蛋白，本研究在大肠杆菌表达系统中将其进行表达、提取和纯化。对Cry1Ie蛋白进行热稳定性和消化稳定性评价，并且分析处理后该蛋白对亚洲玉米螟的杀虫活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒 克隆载体、细菌表达载体pET-21 b，感受态细胞DH5α、Rossetta菌株由本实验室提供。

1.1.2 试剂 各种抗生素均购自美国Amresco公司；常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。酪蛋白（α-casein）、大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybean trypsin inhibitor，STI）、胃蛋白酶（Pepsin）、胰蛋白酶（Trypsin），均购自Solarbio公司；亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、人工饲料由中国农业学院植物保护研究所玉米害虫组提供。

1.1.3 模拟胃消化液（Simulated gastric fluid，SGF）本标准中采用的胃蛋白酶（Pepsin）活力≥3 000U/mg。

根据公式（1）计算100mL模拟胃液中的胃蛋白酶的添加量：

式中，A：胃蛋白酶添加量，单位为毫克（mg）；B：胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克（U/mg）。

“要做到客户去找你，而不是你去找客户，这样才能使企业实现长远发展。”夏碎娒的一席话给我们留下了深刻印象。

称取0.2 g氯化钠（NaCl）和Amg胃蛋白酶，加入70mL重蒸馏水，加入730μL盐酸，再用盐酸调pH至1.2，加水定容至100mL。现用现配。

1.1.4 模拟肠消化液（Simulated gastric fluid，SIF）

称取0.7 g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于25mL重蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液和40mL重蒸馏水，加入1.0 g胰蛋白酶，用0.2mol/L 氢氧化钠溶液调pH至7.5，加重蒸馏水定容至100mL。现用现配。

样品蛋白溶液（2g/L）：称取2mg样品蛋白，定容于1mL重蒸馏水中，混匀。

1.1.5 玉米粉提取液 将非转基因玉米粉在液氮中磨成细粉，称取0.1g，加入1mL重蒸水，混匀后13 500×g、4℃离心5min，取上清。

1.2 方法

1.2.1 蛋白表达与表达条件的优化 挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的5mL LB液体培养基中，37℃、220r/min培养6h，以1％的比例接种于300mL的LB液体培养基中，37℃、220r/min进行培养。当OD600值达到0.5左右时，加入0.1mmol/L IPTG，在18℃、150r/min条件下诱导12h。8000r/min离心10min收集菌体。将菌体再次悬浮于30mL的缓冲液20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，利用超声波破碎菌体（宁波新芝SCIENTZ II-D），功率45％，工作3s，暂停5s，共超声破碎5min。10000r/min 离心20min，分别收集上清和沉淀，然后通过SDS-PAGE电泳检测目标蛋白。在此基础上，挑取部分阳性菌株，通过改变IPTG的浓度（0.1、0.5、1和1.0mmol/L）以及诱导表达的温度（18和30℃），寻找最佳的目标蛋白表达条件。

1.2.2 目的蛋白的纯化 准备5mL的镍柱，首先用无菌水清洗Ni-NTA柱（5倍柱体积），然后用上样缓冲液I（50mmol/L Na2CO3，pH 10.5，含50mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl）进行平衡（5倍柱体积）。加入10mL的蛋白，反复上样4次。用上样缓冲液I洗脱未结合的蛋白（5倍柱体积）。用同样体积的含有250mmol/L咪唑的缓冲液（50mmol/L Na2CO3，pH10.5，含有0.5mol/L NaCl）洗脱目的蛋白。用500mmol/L咪唑的缓冲液（50mmol/L Na2CO3，pH 10.5，含有0.5mol/L NaCl）清洗残余的蛋白，SDSPAGE检测纯化效果。

1.2.3 模拟胃液稳定性测定 向无菌1.5mL离心管中加入18μL模拟胃消化液，37℃恒温水浴5min。分别加入2μL样品蛋白（5mg/mL）、模拟胃液空白对照、不稳定对照蛋白（5mg/mL酪蛋白）、稳定对照蛋白（5mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂），迅速漩涡振荡并快速置于37℃水浴，在每个反应时间点，迅速加入10μL 1.5mol/L 碳酸钠溶液，冰浴，加入7.5μL 5×SDS-PAGE蛋白样品上样缓冲液，沸水浴加热5min，取出后13 500×g离心5min，冷却至室温进行SDS-PAGE检测。蛋白反应时间依次为0和15s，1、2、5、10、30 和 60min。不稳定对照酪蛋白反应时间为2min，稳定对照STI 反应时间为1h。胃蛋白酶对照组为不含胃蛋白酶的模拟胃液，其他步骤同上。

1.2.4 模拟肠液稳定性测定 在已灭菌的1.5mL离心管中加入 18μL模拟肠消化液（SIF）溶液，37℃恒温水浴5min。分别加入2μL样品蛋白（2mg/mL）、模拟肠液空白对照、不稳定对照蛋白（2mg/mL酪蛋白）、稳定对照蛋白（2mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂），漩涡振荡后快速置于37℃水浴中，在每个反应时间点立即加入5μL 5×SDS-PAGE蛋白样品上样缓冲液，沸水浴加热5min，取出后13 500×g离心5min，冷却至室温进行SDS-PAGE检测。反应时间点依次为0和15s、1、2、5、10、30和60min。不稳定对照酪蛋白反应时间为2min，稳定对照STI 反应时间为1h。胰蛋白酶对照组为不含胰蛋白酶的模拟肠液，其他步骤同上。

1.2.5 热稳定性测定 将目的蛋白干粉分别用超纯水和玉米粉提取液中溶解后在沸水浴中加热，在反应时间点取出 20μL，立即加入 5μL 5×SDS-PAGE蛋白样品上样缓冲液，沸水浴加热5min，取出后13 500×g离心5min，冷却至室温进行SDS-PAGE检测。反应时间依次为 15s、1、2、5、10、30和60min。

1.2.6 亚洲玉米螟生物活性测定 亚洲玉米螟选用初孵幼虫，称取30g人工饲料置于灭菌培养皿中，加入3 000μL待测样品溶液，用药匙充分搅拌均匀，室温放置，使饲料多余水分蒸发。将全部饲料分装于3个一次性培养皿中（直径=5cm）。用毛笔轻轻接入幼虫，每培养皿接30头虫，每个处理重复3次，接虫后以2层卫生纸严格密封，防止幼虫逃逸。放置25℃光照培养箱中培养。每日监测培养箱中温度与湿度，湿度＜30％时，及时添加蒸馏水以保持湿度。每天观察，检查光照、湿度、温度以及饲料是否霉变，是否有水蒸气凝结。7d分别调查死、活虫数，计算死亡率、校正死亡率。实验样品分别为模拟胃液37℃消化15s、模拟肠液37℃消化1h、超纯水中100℃放置1h、玉米叶片提取液中100℃放置30min。对照组分别为Cry1Ie原蛋白阳性对照2μg/g和5μg/g、模拟胃液对照、模拟肠液对照、超纯水对照、玉米粉提取液对照。

1.2.7 SDS-PAGE分析 取蛋白样品进行制样，100℃煮沸10min，13 000×g离心10min，取上清点样，4％浓缩胶，10％分离胶，80 V电泳20min，150 V电泳直到胶底边缘。电泳结束后取出凝胶，进行脱色、染色及扫描图谱，参见萨姆布鲁克等［16］的方法。

2 结果

2.1 Cry1Ie蛋白提取及表达条件的确定

通过在不同温度条件和不同浓度的IPTG诱导，结果发现，在30℃时诱导Cry1Ie蛋白表达量明显低于18℃，在18℃时0.1mmol/L IPTG诱导培养条件下，Cry1Ie重组蛋白的表达量最高（图1-A，泳道1）。最终选择18℃、0.1mmol/L IPTG、150r/min诱导12h作为该蛋白提取的最优条件。

图1 不同温度和IPTG浓度下可溶性（A）和包涵体（B）Cry1Ie蛋白的SDS-PAGE检测

2.2 Cry1Ie蛋白纯化

首先对可溶性Cry1Ie蛋白进行Ni-NTA亲和纯化，在250mmol/L咪唑浓度下洗脱出浓度较高的纯蛋白（图2-A）。再将250mmol/L咪唑洗脱下来的蛋白用Millipore进行浓缩后进行分子筛层析，在出现洗脱峰时收集流穿，获得了纯蛋白（图2-B），通过Image J软件分析蛋白纯度达到91％。

2.3 Cry1Ie蛋白在模拟胃液中的稳定性

Cry1Ie蛋白在模拟胃液中不稳定，在15 s内可被消化完全，SDS-PAGE检测不到小片段残留（图3-A）。不稳定对照酪蛋白在模拟胃液中2min后被降解（图3-B，泳道1），而稳定对照STI在1h内没有被完全降解（图3-B，泳道2），说明了该消化体系的稳定性及有效性。

图2 Cry1Ie蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化（A）及Superdex-75分子筛层析纯化（B）

2.4 Cry1Ie蛋白在模拟肠液中的稳定性

Cry1Ie蛋白在模拟肠液中不稳定，在15 s内可被消化，只有少量的抗蛋白酶核心片段蛋白没有被消化（图4）。不稳定对照酪蛋白在模拟肠液中2min后被降解（图4，泳道9），稳定对照STI在1h内没有被降解（图4，泳道12），说明了该消化体系的稳定性及有效性（图4，泳道9-13）。

2.5 Cry1Ie蛋白热稳定性

Cry1Ie蛋白在沸水浴中加热1h后未降解（图5-A，泳道2-6），证明纯蛋白具有热稳定性。为检测转基因玉米中Cry1Ie蛋白的热稳定性，将过量Cry1-Ie蛋白加入玉米粉提取液中，沸水浴中30min，SDSPAGE检测蛋白被完全降解（图5-B，泳道7-12）。

2.6 稳定性实验处理后的Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟的生物活性

本实验中Cry1Ie蛋白浓度为5μg/mL时，校正死亡率为74％，这与Song等［11］的Cry1Ie对亚洲玉米螟的生物活性测定结果是一致的。模拟胃肠液处理后的Cry1Ie蛋白已经失去杀虫活性，100℃超纯水处理1h后的蛋白没有降解，但是已经失去杀虫活性。而在玉米粉提取液中处理30min后的蛋白完全降解，并且失去杀虫活性（表1）。

图3 Cry1Ie蛋白（A）及对照蛋白（B）在模拟胃液中的消化稳定性分析

图4 Cry1Ie蛋白在模拟肠消化液稳定性

3 讨论

本研究获得了纯度为91％的纯Cry1Ie蛋白，证明了体外模拟胃肠液消化后及玉米粉提取液中热处理后Cry1Ie蛋白不稳定，并失去对亚洲玉米螟的杀虫活性。

图5 Cry1Ie纯蛋白（A）在超纯水及在玉米粉提取液中（B）的热稳定性分析

自从1987年以来，转Bt基因抗虫农作物在全世界广泛种植［1］。对转基因农作物、转基因食品进行安全性评价尤为重要。目前用于饲料和食品的转基因Bt 作物主要是玉米。在中国和其他国家获得审批的转基因Bt 植物表达的Cry 蛋白包括Cry1Ab、Cry1F、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry2Ab2、Cry3Bb、Cry34Ab1 和Cry35Ab1等［13］。欧洲食品安全局（EFSA）对玉米植株中所表达的Cry 蛋白的食品安全进行了评估，如 Cry1Ab 和 Cry3Bb1［17］、Cry1F［18］、Cry34-Ab1 和 Cry35Ab1［19］和包含一种以上 Cry 蛋白的玉米杂交品种［20，21］。每一个注册的转基因Bt 作物都要根据国际食品法典的建议进行安全性评价，其中包括蛋白质特性、在模拟消化液中进行稳定性评估、在小鼠中进行急性高剂量口服毒性试验、与已知毒素和致敏原进行氨基酸序列比对及对非靶标生物的作用。对具有商业化前景的Bt作物及其外源蛋白进行评估，为其环境安全性及食用安全性评价奠定基础，体外模拟胃肠液消化稳定性与热稳定性评价恰恰是这方面最基础也是最关键的一个步骤。

表1 稳定性实验处理后的Cry1Ie蛋白对亚洲玉米螟室内毒力测定结果

本研究选择具有应用前景的Cry1Ie蛋白，并获得了大量可溶性蛋白，纯度达到91％这与此前的Song等［10］所做的表达相比，增加了蛋白的可溶性。根据Guo等［22］所做的IE648蛋白的表达纯化相比，仅仅用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析就获得了纯度高的Cry1Ie蛋白，大大提高了纯化效率。

在2009年，Xu等［7］对Cry1Ab/Ac融合蛋白进行了消化稳定性和热稳定性评价，发现Cry1Ab/Ac蛋白在模拟消化液中不稳定，与本研究的结果一致。但是在热稳定性评价实验中，Xu只将目的蛋白溶解于20mmol/L Tris-HCl中进行了热稳定性评价，而本研究同时将 Cry1Ie蛋白溶解于玉米粉提取液中进行热稳定性评价，证明了其在玉米粉提取液中的热不稳定性。这一实验模拟了该蛋白作为膳食来源经过一系列加工后进入人体的可能途径。在对Cry1Ie蛋白进行消化稳定性和热稳定性实验后，该蛋白都会以小肽或氨基酸的形式存在，而这些物质在人体内仅能够作为膳食来源的营养物质。除了花粉蛋白，其他所有免疫原性蛋白对消化酶都有极高的稳定性，因此蛋白质的稳定性可以被认为是预测蛋白质免疫原性的重要参考数据［23］。蛋白质经过胃蛋白酶消化后形成小于3.5kD的小肽和氨基酸，则被认为几乎不可能具有免疫原性［24］。根据以上研究进展，可以初步判断，Cry1Ie蛋白不具有免疫原性。但是这只是一个初步的判断，并不能完全证明其无免疫原性。因为目前还没有发现抗蛋白酶消化与免疫原活性有直接的关系［24］。

4 结论

通过Ni-NTA亲和层析系统和分子筛层析系统获得了Cry1Ie的纯蛋白，纯度达到91％对亚洲玉米螟具有较高的杀虫活性。通过模拟消化实验，证明Cry1Ie蛋白在体外模拟胃肠液中不稳定，15 s即被降解，对亚洲玉米螟失去杀虫活性。热稳定性实验证明，Cry1Ie蛋白在沸水浴中加热1h后没有降解，并且保持对亚洲玉米螟的杀虫活性。但是该蛋白在玉米粉提取液中不稳定，在沸水浴中30min即被降解，对亚洲玉米螟失去杀虫活性。

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