南极磷虾富脂蛋白的降胆固醇及降血糖活性

徐文思，米云龙，张建润，周大勇，乔维洲

（1.大连工业大学国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁大连　116034；2.大连市中心医院，辽宁大连　116033）

南极磷虾富脂蛋白的降胆固醇及降血糖活性

徐文思1，米云龙1，张建润1，周大勇1，乔维洲2

（1.大连工业大学国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁大连116034；2.大连市中心医院，辽宁大连116033）

通过等电点沉淀法提取南极磷虾富脂蛋白，以喂养高胆固醇饲料建立大鼠高胆固醇血症模型，评价了富脂蛋白的降胆固醇、降血糖活性。富脂蛋白中蛋白质、油脂、灰分质量分数分别为58.64%、27.76%、8.40%。富脂蛋白中脂质的磷脂、甘油三酯、游离脂肪酸、胆固醇分别占总脂质的17.11%、73.54%、4.86%和2.90%；PUFA、DHA、EPA分别占总脂肪酸的17.33%、2.74%、6.92%。高胆固醇血症大鼠摄入富脂蛋白4周后，低、高剂量组大鼠血浆中的总胆固醇水平显著降低、低密度脂蛋白胆固醇水平极显著降低；摄入富脂蛋白能够缓解由于喂饲高胆固醇饲料带来的模型组大鼠高密度脂蛋白胆固醇水平的持续下降；各个剂量组大鼠血糖水平均下降，其中低剂量组大鼠血糖水平显著降低。

南极磷虾；富脂蛋白；降胆固醇；降血糖

0　引　言

南极磷虾（Euphausiasuperba）是重要的潜在渔业资源，也是我国未来将重点开发利用的渔业资源。干基南极磷虾的油脂质量分数约在10%～20%，主要由甘油酯、磷脂、游离脂肪酸、甾醇及虾青素组成［1－2］。研究表明，南极磷虾油具有抑制肝脂肪化［2－3］、降血脂［2，4］及心脏保护等活性［5］。目前，南极磷虾油常用的提取方法是溶剂浸出法，该方法提取效率高，对极性、非极性油脂均可完全提取。然而，溶剂浸出法工业化生产时存在环境风险高，需要的厂区空间大，提取过程中高温操作易破坏虾青素，溶剂残留可能影响油脂的食用安全性等问题。

等电点沉淀法是一种常用的水产动物蛋白制备方法。Gigliotti等［6－8］均采用等电点沉淀法从南极磷虾中提取蛋白质。Wang等［8］的研究表明，通过等电点沉淀法制备的南极磷虾蛋白，油脂质量分数达33.01%，是一种富含油脂的蛋白。本实验以南极磷虾为原料，通过等电点沉淀法制备南极磷虾富脂蛋白，并通过建立大鼠高胆固醇血症模型，研究南极磷虾富脂蛋白的降血脂、降血糖活性，以期为开发新型南极磷虾油产品提供依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

冻南极磷虾（Euphausiasuperba），大连海洋渔业集团公司；雄性Wistar大鼠，90～110g，大连医科大学实验动物中心；高胆固醇饲料，北京华阜康生物科技股份有限公司，配方参照文献［9－10］并略作调整，由84.3%基础饲料、2.5%胆固醇、10%猪油、5%蛋黄粉配制而成。

正己烷、甲醇，色谱纯；氢氧化钠、浓盐酸、三氯甲烷、无水乙醚等，均为分析纯。LG－1.0型真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；5975C气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司；MK－6s棒状薄层层析仪，日本雅特隆公司。

1.2实验方法

1.2.1等电点沉淀法分离南极磷虾蛋白

以下操作均在0～4℃下完成。南极磷虾冻虾解冻、匀浆，与蒸馏水按质量体积比1／3（g／mL）的比例搅拌混合，调节pH＝12，搅拌浸提30min，将混合液离心（4000r／min，15min）得到上清液A和沉淀A。以沉淀A为原料重复上述浸提过程，得到上清液B。合并上清液，调至pH＝4，静置沉淀20min，离心（4000r／min，15min）得到沉淀B，将沉淀B冷冻干燥得到南极磷虾富脂蛋白。

1.2.2化学组成测定

水分含量测定：AOAC（1990）标准方法952.08［11］；灰分含量测定：AOAC（1990）标准方法938.08［11］；粗蛋白含量测定：AOAC（1990）标准方法981.10［11］，氮含量×6.25；总糖含量测定：苯酚硫酸法（以葡萄糖为标准）［12］；总脂含量测定：索氏提取法［13］。

1.2.3脂质组成与脂肪酸组成测定

采用TLC－FID分析法［14］测定样品的脂质组成，采用GC－MS分析法［14］测定样品的脂肪酸组成，采用索氏提取法制备脂质样品［13］。

1.2.4高胆固醇血症大鼠模型的建立

正式实验前，将Wistar大鼠适应性喂养1周，期间进食普通饲料，自由饮水。动物室内照明控制在12h／12h光暗周期节律，气温（23± 2）℃。1周后，随机选取6只大鼠作为正常对照组，继续进食普通饲料，其余24只大鼠为模型组，进食高胆固醇饲料。两组动物均自由饮水。

建模4周后，将大鼠禁食12h（自由饮水），用苯巴比妥钠麻醉，眼眶后静脉丛取血，分离血浆。大鼠血浆标本经大连市中心医院全自动生化分析仪进行检测，检测项目包括总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（L－DLC）、高密度脂蛋白胆固醇（H－DLC）、葡萄糖（Glu）。

1.2.5高胆固醇血症大鼠的降胆固醇实验

根据模型组大鼠的体重及血浆TC水平将其分为4组，每组6只，分别为模型对照组、高剂量富脂蛋白组（H－LRPs）、中剂量富脂蛋白组（MLRPs）、低剂量富脂蛋白组（L－LRPs），各组分别灌胃生理盐水，120、30、7.5mg／kg富脂蛋白，每日灌胃1次，持续4周，期间模型组大鼠继续进食高胆固醇饲料，自由饮水。灌胃4周后，将大鼠禁食12h（自由饮水），取血，分离血浆，检测TC、L－DLC、H－DLC、Glu水平。

1.2.6统计分析

数据用平均值±标准差（M±SD）表示，所得数据使用SPSS16.0软件进行t检验。

2　结果与分析

2.1南极磷虾富脂蛋白的化学组成

南极磷虾蛋白提取物中含蛋白质58.64%，油脂27.76%，灰分8.40%。由于该蛋白中油脂含量较高，可称为南极磷虾富脂蛋白。

2.2南极磷虾富脂蛋白的脂质组成

表1显示了南极磷虾富脂蛋白中各类脂质占总脂质的质量分数。富脂蛋白脂质中磷脂与甘油三酯分别占总脂质的（17.11±0.55）%和（73.54± 0.93）%。

表1　南极磷虾富脂蛋白的脂质组成Tab.1　Compositions　of　lipid　from　lipid－rich proteins

2.3南极磷虾富脂蛋白的脂肪酸组成

表2显示了所制备的南极磷虾富脂蛋白中脂质的脂肪酸组成。富脂蛋白脂质中PFUA、EPA、DHA分别占总脂肪酸的17.33%、6.92%和2.74%。

表2　南极磷虾富脂蛋白的脂肪酸组成Tab.2　Fatty　acids　compositions　of　lipid　from lipid－rich　proteins

2.4高胆固醇血症大鼠模型的检测评价

从表3中可以看出，喂食高胆固醇饲料4周后，模型组大鼠体重增长量显著高于喂食普通饲料的正常对照组大鼠的体重增长量（P＜0.05）。与喂食高脂饲料前（第0周）相比，喂食高脂饲料4周后模型组大鼠血浆TC、L－DLC及Glu水平均极显著上升（P＜0.01），而H－DLC水平则极显著下降（P＜0.01）。同时，模型组大鼠血浆TC、L－DLC及Glu水平极显著高于正常对照组大鼠（P＜0.01）。结果表明，摄入高胆固醇饲料4周可以引发大鼠的高胆固醇及高血糖血症，动物模型建立成功。

2.5富脂蛋白的降血脂及降血糖活性

2.5.1富脂蛋白对高胆固醇血症大鼠体重的影响

图1为摄入南极磷虾富脂蛋白4周后各组大鼠体重的增长情况。从结果可以看出，与未摄入富脂蛋白的模型对照组相比，低、高剂量富脂蛋白组大鼠的体重增长量降低，但结果均未显示统计学差异。

图1　富脂蛋白对高胆固醇血症大鼠体重增长量的影响Fig.1　Effect　of　the　lipid－rich　proteins　on　body weight　gain　of　hypercholesterolemic　rats

2.5.2富脂蛋白对高胆固醇血症大鼠血浆TC水平的影响

图2为摄入南极磷虾富脂蛋白4周后各组大鼠血浆的TC水平变化情况。从结果可以看出，与摄入富脂蛋白前相比，低、高剂量富脂蛋白组大鼠血浆中的TC水平显著降低（＊P＜0.05），而模型对照组和中剂量富脂蛋白组大鼠血浆中的TC水平均虽有降低但结果无显著性差异。这表明，富脂蛋白具有降低高胆固醇大鼠血浆中TC水平的能力。

图2　富脂蛋白对大鼠TC水平的影响Fig.2　Effect　of　the　lipid－rich　proteins　on　the　serum TC　level

2.5.3富脂蛋白对高胆固醇血症大鼠血浆L－DLC水平的影响

图3为摄入南极磷虾富脂蛋白4周后各组大鼠的血浆L－DLC水平变化情况。从结果可以看出，与摄入富脂蛋白前相比，低、高剂量富脂蛋白组大鼠血浆中的L－DLC水平极显著降低（＊＊P＜0.01），而模型对照组与中剂量富脂蛋白组大鼠血浆中的L－DLC水平均虽略有降低但结果无显著性差异。这表明富脂蛋白具有降低高胆固醇大鼠血浆中L－DLC水平的能力。

表3　高胆固醇饲料对大鼠体重及血浆中各检测指标的影响Tab.3　Indexes　of　rat　plasma　fed　on　high　cholesterol　diet　mmol／L

图3　富脂蛋白对大鼠L－DLC水平的影响Fig.3　Effect　of　the　lipid－rich　proteins　on　the　serum L－DLC level

2.5.4富脂蛋白对高胆固醇血症大鼠血浆HDLC水平的影响

图4为摄入南极磷虾富脂蛋白4周后各组大鼠的血浆H－DLC水平变化情况。从结果可以看出，模型对照组大鼠又经过4周的高胆固醇饲料喂养后，血浆H－DLC水平极显著降低（＊＊P＜0.01），这说明造模成功后，继续摄入高胆固醇饲料，模型大鼠血浆的H－DLC水平仍会持续下降。相比之下，低、中、高剂量富脂蛋白组大鼠血浆中的H－DLC水平虽有降低但结果并无显著性差异。这说明摄入富脂蛋白能够缓解由于喂饲高胆固醇饲料带来的模型大鼠H－DLC水平的持续下降。

图4　富脂蛋白对大鼠H－DLC水平的影响Fig.4　Effect　of　the　lipid－rich　proteins　on　the　serum H－DLC　level

2.5.5富脂蛋白对高胆固醇血症大鼠血浆Glu水平的影响

图5为摄入南极磷虾富脂蛋白4周后各组大鼠的血浆Glu水平变化情况。从结果可以看出，模型对照组又经过4周的高胆固醇饲料喂养后，血浆Glu水平略有升高，但结果无统计学意义。相比之下，摄入富脂蛋白4周后，各个剂量组大鼠血浆Glu水平均下降，其中低剂量组大鼠血浆中的Glu水平显著下降（＊P＜0.05）。这说明摄入富脂蛋白能够抑制由于喂饲高胆固醇饲料带来的模型大鼠Glu水平的持续上升。

图5　富脂蛋白对大鼠Glu水平的影响Fig.5　Effect　of　the　lipid－rich　proteins　on　the　serum Glu　level

3　讨　论

Wang等［8］制备的南极磷虾蛋白中，粗蛋白质量分数66.96%，油脂质量分数33.01%，其中的磷脂质量分数占总脂质的38.57%，PUFA、EPA和DHA分别占总脂肪酸的21.00%、13.65%和7.17%，均略高于本研究的相应数值，这可能由于不同批次的南极磷虾存在成分上的差异所致。Tandy等［2，4，14］研究表明，摄入南极磷虾油能够显著降低高胆固醇血症小鼠、大鼠的体重增长量。研究还表明，摄入南极磷虾油能够降低高胆固醇血症小鼠［2］和大鼠［4，14］血浆中TC和Glu水平；能够降低高胆固醇大鼠血浆中L－DLC水平，并缓解高脂饲料喂养带来的大鼠H－DLC水平的持续降低［14］。本研究结果表明南极磷虾富脂蛋白具有降胆固醇、降血糖的活性，可以作为原料开发新型南极磷虾油产品。

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Cholesterol－loweringandglucose－loweringeffectsoflipid－richproteins fromAntarctickrill（Euphausiasuperba）

XUWensi1，MIYunlong1，ZHANGJianrun1，ZHOUDayong1，QIAOWeizhou2
（1.NationalEngineeringResearchCenterofSeafood，DalianPolytechnicUniversity，Dalian116034，China；2.DalianMunicipalCentralHospital，Dalian116033，China）

Inthisstudy，lipid－richproteins（LRPs）werepreparedfromAntarctickrill（Euphausia superba）byisoelectricpointprecipitation.ExperimentalhypercholesterolemiainWistarratswas establishedbyfeedingwithahigh－cholesteroldiet（HCD），whichwasusedtoevaluatethe cholesterol－loweringandglucose－loweringeffectsoftheLRPs.TheLRPsconsistedof58.64% protein，27.76%fatand8.40%ash.LipidsofLRPsconsistedof17.11% phospholipid，73.54% triacylglycerol，4.86%freefattyacidand2.90%cholesterol.Infurther，PUFA，DHAandEPA accountedfor17.33%，2.74%and6.92%oftotalfattyacids.Hypercholesterolemiaratswerefed withLRPsforfourweeks.ResultsindicatedthathighandlowdoseofLRPscouldsignificantlyreduce theplasmalevelsoftotalcholesterol（TC）andlow－densitylipoproteincholesterol（LDL－C）.Atthe sametime，LRPscouldinhibitthedeclineinlevelsofplasmahigh－densitylipoproteincholesterol（HDL－C）.Furthermore，theplasmaglucoselevelsweredecreasedafterintakeofLRPsforfour weeks.However，justthedecreaseinlowdosegrouphadstatisticalsignificance.

Antarctickrill（Euphausiasuperba）；lipid－richproteins；cholesterol－loweringeffect；glucose－lowering effect

TS254.5

A

1674－1404（2015）02－0079－05

2015－01－06.

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA090801）；辽宁省高等学校重大科技平台项目（2011191）.

徐文思（1990－），女，硕士研究生；通信作者：乔维洲（1976－），男，副主任检验技师.