HPLC-UV法测定五味子中5-羟甲基糠醛

李 越，　安开龙，　李德坤，　杨悦武，　余伯阳，　鞠爱春*

（1.中国药科大学，江苏　南京　210009；2.南京农业大学，江苏　南京　210095；3.天津天士力之骄药业有限公司，天津　300402）

HPLC-UV法测定五味子中5-羟甲基糠醛

李 越1，安开龙2，李德坤3，杨悦武3，余伯阳1，鞠爱春3*

（1.中国药科大学，江苏南京210009；2.南京农业大学，江苏南京210095；3.天津天士力之骄药业有限公司，天津300402）

目的 建立五味子药材中5-羟甲基糠醛（5-HMF）的定量测定方法。方法 采用HPLC-UV，Diamonsi1C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）；检测波长284 nm；体积流量1 mL/min；柱温30℃。结果 5-羟甲基糠醛在1.14～18.21μg/mL范围内线性关系良好，平均回收率为100.1%，RSD为1.0%。五味子鲜果和干燥种子中均未检出5-HMF，干燥果肉中5-HMF含有量较高，12批五味子中5-羟甲基糠醛的含有量范围为0.09～2.40 mg/g。结论 五味子中的5-羟甲基糠醛主要是由五味子鲜果果肉在加热烘干过程中产生，不同批号的五味子中5-HMF的量差异较大。

五味子；5-羟甲基糠醛；HPLC-UV

五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Bai11.为木兰科五味子属Schisandra多年生左旋落叶木质藤本植物，其成熟果实干燥后作药用，因其果实甘、酸、辛、苦、咸五味俱全，故名五味子［1］，主产于黑龙江、吉林、辽宁等地，习称“北五味子”。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能。用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症［2］。五味子多为9月前后成熟，为浆果，果实含水量较高，采收后需及时加工干燥以利于贮存保证药材品质。传统多采用阴干、晒干等方式，因其需要大量劳动力且受天气情况影响干燥过程不易控制，现多采用烘干的方式进行干燥。但是不同的干燥时间和干燥温度对药材品质具有重要影响［3］。

5-羟甲基糠醛（5-HMF），又称5-羟甲基-2-糠醛，是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下产生的一个醛类化合物，是Mai11ard反应的典型产物之一［4］，温度对美拉德反应的影响较大，5-HMF的含有量随着温度的升高呈上升趋势［5-6］。文献中表述该化合物对人体横纹肌和内脏有损害［7］，具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生积蓄中毒，《中国药典》2010年版二部中明确规定了它在含葡萄糖注射液中的限量［8］。此外，近年来也有研究表明，它具有抗氧化、抗心肌缺血、改变血液流变学等对人体有益的作用［9-10］。目前5-HMF测定主要为UV法和HPLC法［9］，五味子应用广泛，在加工干制的过程中会产生5-HMF。目前文献报道的有关五味子中5-HMF的定量测定多是以加热煎煮提取5-HMF［3，11］，五味子药材在加热的过程中可能会产生新的5-HMF，造成测量结果不能客观地反映原始药材中5-HMF的量。因此，本实验采用冰浴超声提取五味子药材中的5-HMF，避免加热对5-HMF含有量的影响，建立五味子药材中5-HMF定量测定的HPLC法，为药材的质量控制提供科学依据。

1　仪器和试药

1.1仪器与试剂 Agi1ent1100型高效液相色谱仪（美国Agi1ent公司），万分之一天平（AL204梅特勒-托利多仪器有限公司），十万分之一天平（XS105梅特勒-托利多仪器有限公司），Mi11i-Q超纯水机，电热鼓风干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司制造），超声波清洗器（KQ5200型，昆山市超声波仪器有限公司），L-550低速自动平衡离心机（长沙湘仪离心仪器有限公司），WK-200B高速药物粉碎机（青州市精诚机械有限公司）。

5-HMF对照品（批号111626-201308，中国食品药品检定研究院），甲醇（色谱纯），醋酸（色谱纯），水为实验室自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2药材 五味子鲜果于2013年9月15日采自辽宁省新宾县，五味子干燥果实、种子和果肉由鲜果在相同的条件下烘干而成，20081001等12批五味子药材由天津天士力之骄药业有限公司提供（产地辽宁），以上药材经中国药科大学余伯阳教授鉴定。

2　方法与结果

2.1色谱条件 Diamonsi1C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）等度洗脱；体积流量1 mL/min；检测波长284 nm；柱温30℃；进样量10μL；外标法定量。在本色谱条件下，5-HMF色谱峰分离较好。结果见图1。

图1　对照品（A）、样品（B）和空白（C）HPLC图谱Fig.1　HPLC chromatograms of reference substances（A）、sam p Ie（B）and b Iank（C）

2.2供试品溶液的制备 取五味子药材粉末（过60目筛）约1.00 g，精密称定，置离心管中，加入甲醇12 mL，冰浴超声提取，每次25 min，共提取4次，合并提取液，离心，过滤，至50 mL量瓶中，用甲醇加至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.3对照品溶液的制备 精密称取5-HMF对照品6.07 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀。从中精密吸取3 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得，4℃储藏备用。

2.4线性关系的考察 精密量取对照品贮备液，分别稀释2、4、8、10、16、32倍，分别进样10 μL，按照“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得对照品的标准曲线，线性回归方程为A= 55 810C+1.092 1，r=0.999 9，5-HMF在1.14～18.21μg/mL范围内线性关系良好。

2.5精密度试验 精密吸取对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，进样量10μL，测定5-HMF的峰面积。测得5-HMF峰面积的RSD为0.2%。结果表明仪器的精密度良好。

2.6稳定性试验 取新制的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h按“2.1”项下色谱条件进行色谱分析。测得5-HMF峰面积的RSD为1.0%。结果表明样品在10 h内稳定性良好。

2.7重复性试验 分别精密称取样品（批号20081001）6份，分别按“2.2”项下供试品制备方法和“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。测得5-HMF平均含有量为0.161 8mg/g，RSD为2.0%，表明该方法重复性良好。

2.8加样回收率试验 精密称取9份已知含有量的五味子药材粉末（批号20081001），每份0.50 g，精密称定，根据其含有量的80%、100%、120%分别加入对照品贮备液1.8、2.2、2.7 mL，平行3份，按照“2.2”项下方法制备，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率和RSD值。结果表明其平均加样回收率为100.1%，RSD为1.0%。具体结果见表1。

表1　5-HMF加样回收率试验结果Tab.1 Resu Its of recovery tests for 5-HMF

2.9检测限与定量限 在选定的色谱条件下，精密量取5-HMF对照品溶液适量，逐级稀释进样。最终确定检测限为0.04 ng（S/N=3），定量限为2.85 ng（S/N≥10）。

2.10样品测定 分别按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以峰面积代入回归方程中计算5-HMF的量，结果见表2。

五味子鲜果和五味子干燥种子中未检出5-羟甲基糠醛，五味子干燥果实和干燥果肉中均含有5-羟甲基糠醛，且干燥果肉中5-羟甲基糠醛含有量较高。检测了2008—2013年的12批五味子干燥果实样品，其含有量差异较大，范围为0.09～2.40 mg/g。

表2　五味子不同部位及不同批号样品中5-HM F测定结果（n=3）Tab.2 Content of 5-HMF in different parts and batches of Schisandra chinensis（n=3）

3　讨论

3.1检测波长的确定 采用PDA检测器对5-HMF进行扫描，结果显示5-HMF在284 nm有最大吸收波长，所以本实验选择284 nm作为测定波长。另外，本实验采用PDA检测器对样品和对照品进行了峰纯度验证，结果表明在本实验所确定的检测条件下，5-HMF峰不含其他干扰成分。

3.2提取方法的选择 5-HMF的生成与温度密切相关，温度较高可能导致或加速美拉德反应的发生［5-6，12］，所以没有考虑热提取的方法以避免加热过程产生影响。本实验考察了冰浴超声提取法与冰浴振摇提取法，结果表明两种方法相差不大，考虑到超声提取法操作简单故确定了本实验样品制备方法。

3.3提取溶剂用量，提取时间，提取次数的选择通过单因素试验和正交试验最终确定溶剂用量为12倍甲醇，冰浴超声提取4次，每次25 min。由于本实验超声提取时间较长，为了验证5-HMF在提取条件下是否发生变化，将定容摇匀后的提取液，分别超声0、30、60、90、120、150 min，测定，其RSD为0.5%，说明在本实验超声提取过程中5-HMF未发生变化。

3.4色谱条件的选择 选用了不同比例的甲醇-0.5%醋酸水，结果发现比例为15∶85，10∶90和5∶95时5-HMF的分离效果和峰形没有明显区别，但是后两者保留时间较长，为了节省分析时间，所以选择甲醇-0.5%醋酸水（15∶85）为流动相。选择了不同牌子的色谱柱XAqua C18（4.6 mm×250 mm，10μm），Diamonsi1C18（4.6 mm×250 mm，5μm）和Waters symmrtry C18（4.6 mm×250 mm， 5μm），发现Diamonsi1C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）峰形最好，所以选用Diamonsi1C18（2）色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm）。

3.5本实验分别用水、甲醇、不同体积分数的乙醇、乙酸乙酯冰浴超声提取五味子新鲜果实1 h，以及用水冷浸24 h后再冰浴超声提取1 h，均未检出5-HMF，说明5-HMF并不是在五味子生长过程中产生的。对五味子干燥全果、果肉、种子的检测发现种子中未检出5-HMF，干燥后的果实和果肉中均检出5-HMF，且果肉中5-HMF含有量较高，说明五味子药材中的5-HMF主要来源于果肉部分，可能是由五味子果肉中的糖在加热烘干的过程中产生，这有利于研究五味子中5-HMF的产生机理。不同批号的五味子药材中5-HMF的含有量差异较大，可能是由于加工干制的过程中烘干时间和温度等条件不统一，这说明对五味子药材中5-HMF建立合适的限度标准，从而对规范五味子的加工干制过程和提高五味子药材的质量具有重要意义。

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Determ ination of 5-hydroxmethy IfurfuraI in Schisandra Chinensis Fructus by HPLC-UV

LIYue1， AN Kai-1ong2， LIDe-kun3， YANG Yue-wu3， YU Bo-yang1， JU Ai-chun3*
（1.China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；3.Tianjin Tasly Pride Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China）

AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining 5-hydroxymethy1furfura1 in Schisandra Chinensis Fructus.METHOD The HPLC ana1ysiswas performed on a Diamonsi1C18（2）co1umn（4.6mm×250 mm，5 μm）and themobi1e phase consisted ofmethano1-0.5%acetic acid（15∶85）at a f1ow rate of 1.0 mL/min.The detection wave1ength was setat284 nm and the co1umn temperaturewasmaintained at30℃.RESULTS The 1inear range of 5-hydroxmethy1furfura1was in the range of 1.14-18.21μg/mL（r=0.999 9），average recovery was 100.1%，and RSD was 1.0%.5-HMF was undetected in fresh and dried seeds of S.chinensis Fructus，but their dried pu1ps presented the higher content.5-HMF content in 12 batches of S.chinensis Fructus was in the range of 0.086 1-2.395 8 mg/g.CONCLUSION The 5-HMF is produced in the process of heating dried of fresh pu1ps of Schisandra chinensis Fructus.5-HMF content ismain1y stemmed from the hot-processing pu1p of S.chinensis.There are significant differences of 5-hydroxmethy1furfura1 in Schisandra chinensis Fructus among different batches.

Schisandra chinensis Fructus；5-hydroxymethy1furfura1；HPLC-UV

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0142-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.029

2014-03-01

李 越（1989—），女，硕士生，主要从事中药质量控制研究。Te1：（022）26736121，E-mai1：1iyuehappy@163.com

鞠爱春（1973—），男，副高级工程师，主要从事中药注射剂工艺及质量控制方向的研究。E-mai1：juach@tas1y.com