不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经功能及氧化应激的作用

贲 莹，　张凤华，　梁文杰，　张 冬，　方 倩

（河北中医学院中西医结合学院，河北　石家庄　050200）

不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病大鼠周围神经功能及氧化应激的作用

贲 莹，张凤华，梁文杰，张 冬，方 倩

（河北中医学院中西医结合学院，河北石家庄050200）

目的 探讨不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病周围神经病变大鼠周围神经功能及氧化应激的作用。方法 用链脲佐菌素（STZ）诱导建立SD大鼠糖尿病周围神经病变模型，并随机分为模型组、黄芪60 g组、黄芪120 g组和α-硫辛酸组。黄芪60 g组和黄芪120 g组分别用含对应量黄芪的补阳还五汤浓煎剂灌胃，α-硫辛酸组用20 mg/（kg·d）α-硫辛酸灌胃。另设正常组。给药12周后，检测空腹血糖（FBG）、坐骨神经传导速度，血中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）水平以及坐骨神经半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性。结果 与正常组相比，模型组的FBG、MDA水平和caspase-3活性明显升高，坐骨神经传导速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明显下降（P＜0.01）。与模型组比较，黄芪120 g组和α-硫辛酸组MDA水平和caspase-3活性明显下降，坐骨神经传导速度、SOD、CAT、GSH-Px的活力明显上升（P＜0.05，P＜0.01）；黄芪60 g组坐骨神经传导速度、SOD、CAT的活力明显上升，MDA水平显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。与黄芪60 g组比较，黄芪120 g组SOD活性显著提高（P＜0.01）；神经传导速度、CAT、GSH-Px活性有增高趋势，MDA水平及caspase-3活性有减低趋势，但差异无统计学意义。黄芪120 g组与α-硫辛酸组比较各指标无统计学差异。结论 补阳还五汤能有效减低糖尿病周围神经病变大鼠的氧化应激反应，发挥其保护作用。120 g黄芪用量的补阳还五汤抗氧化作用略佳。

糖尿病周围神经病变；氧化应激；补阳还五汤；黄芪

糖尿病周围神经病变是常见的糖尿病慢性并发症之一，发病率高达90%［1］，其发病机制尚未完全阐明，但大量研究表明氧化应激可以直接或间接地损伤神经细胞，在糖尿病周围神经病变的发生中起到了重要作用［2-3］。中医认为本病主要为络气虚滞，淤血阻络［4］，临床治法上我们应用补气活血通络的补阳还五汤加减治疗取得了较好的疗效。但对其能否通过改善氧化应激而减少周围神经损伤，还缺少客观实验证据。本研究旨在观察不同黄芪剂量补阳还五汤对糖尿病周围神经病变大鼠氧化应激及周围神经功能的作用，以期明确补阳还五汤方发挥治疗作用的途径、效果及方中黄芪的最佳剂量，以指导临床用药及科研。

1　材料

1.1动物 雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g（2月龄左右），购自河北医科大学实验动物中心，单位许可证号SYXK（冀2008-0026）；动物合格证号1301053。

1.2药物 补阳还五汤原方来源《医林改错》，黄芪120 g，当归6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g，简称黄芪120 g组。另设黄芪60 g，其余药物剂量不变，简称为黄芪60 g组。以上两组药物分别加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后两次药液合并、浓缩，分别制成含生药2.4、1.36 g/mL的药液。α-硫辛酸购于Puritan's Pride公司（100 mg×60粒，批号：250597-09 EXP 10/12）。

1.3试剂 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购于Sigma公司；微量丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（g1utathion peroxidase；g1utathione peroxidase，GSH-Px）测试盒购于南京建成生物工程研究所；大鼠半胱天冬酶3（caspase-3）酶联免疫检测试剂盒构于BG公司

1.4仪器 One touchII型血糖仪（美国强生公司）；DANTEC Cantata肌电图诱发电位仪；岛津紫外分光光度计UV-1700，pharmaSpec SHIMADIU。

2　方法

2.1分组、建立动物模型 60只SD大鼠按体质量相似随机分为5组，正常组、模型组、黄芪60 g组、黄芪120 g组、α-硫辛酸组，每组10只。在禁食12 h后模型组、黄芪60 g组、黄芪120 g组、α-硫辛酸组大鼠予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h测鼠尾静脉血，血糖≥16.7 mmo1/L确立为糖尿病大鼠模型，正常对照组大鼠注射等量的柠檬酸缓冲液。

2.2给药 造模成功立即开始灌胃，黄芪60 g组、黄芪120 g组按10 mL/（kg·d）分别用相应黄芪量药液灌胃；α-硫辛酸组按20 mg/（kg·d）用α-硫辛酸灌胃；正常组和模型组给予等体积的蒸馏水。实验期间自由饮食，连续给药12周。

2.3观察指标

2.3.1坐骨神经传导速度测定 给药结束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌电图仪检测大鼠右侧坐骨神经传导速度［5］。以坐骨窝为第一刺激部位，踝部为第二刺激部位。均经皮插入2个针电极，间距为2 mm，尾部接地，保持皮温30℃。（1）运动神经传导速度（MCV）：方形波刺激神经，用2个针电极于同侧足部骨间肌，记录复合肌肉动作电位及潜伏期。检测3对不同M波的潜伏期，取平均值。两个刺激部位间的传导时间为近端、远端潜伏期差，测量两个刺激部位间的距离。运动神经传导速度（m/s）=距离/潜伏期差值。（2）感觉神经传导速度（SCV）：方形波记录6对在坐骨窝和踝激发的H反射潜伏期，测量两个刺激部位间的距离。感觉神经传导速度（m/s）=距离/潜伏期差值。

2.3.2血液指标测定 每月1次尾静脉采血，血糖仪测定空腹血糖（FBG）；给药结束取血，比色法测定SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA水平。

2.3.3坐骨神经caspase-3活性检测 给药结束后，腹腔注射乌拉坦麻醉大鼠，分离双侧坐骨神经，迅速取下，用预冷的0.9%氯化钠溶液洗去杂质和血渍，滤纸吸干，在-196℃液氮中保存。按试剂盒说明用酶联免疫吸附法测定Caspase-3活性。

2.4统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件处理数据，检测结果±s表示，组间均数比较采用方差分析和SNK法两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　不同时间点各组大鼠空腹血糖及坐骨神经传导速度（±s，n=10）

表1　不同时间点各组大鼠空腹血糖及坐骨神经传导速度（±s，n=10）

注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别空腹血糖/（mmo1·L-1）4周8周12周MCV/（m·s-1）SCV/（m·s-1）正常组4.96±0.63△△5.02±0.58△△4.87±0.51△△45.26±4.35△△46.45±7.12△△模型组26.54±3.77 25.83±4.14 26.10±3.81 30.17±5.16 29.21±9.38黄芪60 g组27.21±3.26 26.36±3.52 25.97±2.72 35.82±6.36△37.06±6.74△黄芪120 g组26.25±3.89 25.74±3.16 24.16±3.05 37.32±6.22△40.17±5.22△△α-硫辛酸组26.12±4.02 26.27±3.35 26.14±3.44 36.79±7.08△39.55±6.38△

3　结果

3.1空腹血糖变化 模型组、黄芪120 g组、黄芪60 g组、α-硫辛酸组FBG显著高于正常组。黄芪120 g组FBG略低于模型组，但差异无统计学意义。见表1。

3.2各组坐骨神经传导速度的比较 与正常组比较，模型组坐骨神经MCV和SCV明显减慢（P＜0.01）；与模型组比较，黄芪60 g组、黄芪120 g组和α-硫辛酸组MCV和SCV明显提高（P＜0.05），其中黄芪120 g组SCV增高更明显（P＜0.01）；三药物干预组间比较无统计学差异。见表1。

3.3各组氧化指标及caspase-3活性的变化 模型组比正常组SOD、GSH-Px、CAT活性均明显下降（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄芪60 g组MDA水平降低（P＜0.05），SOD活性上升（P＜0.01）CAT水平升高（P＜0.05）；黄芪120 g组及α-硫辛酸组SOD、GSH-Px、CAT活性均上升（P＜0.01），MDA水平、caspase-3活性显著降低（P＜0.01）。三药物干预组间比较黄芪120 g组与α-硫辛酸组SOD活性较黄芪60 g组升高（P＜0.01），其余指标无统计学差异。见表2。

表2　各组大鼠血液SOD、GSH-Px、CAT活性、MDA及坐骨神经caspase-3活性比较

4　讨论

糖尿病周围神经病变是糖尿病主要的慢性并发症，其发病机制目前尚未完全明了，一般认为与多元醇通路、己糖胺途径、蛋白激酶C途径的激活和糖基化终产物的形成、微血管病变、氧化应激反应等诸多因素有关［6-7］。其中氧化应激在周围神经病变中的作用受到了越来越多的重视。Brown1een［8］提出的统一机制学说认为，经典的糖尿病并发症的多元醇途径、糖基化终产物（AGES）途径、蛋白激酶C（PKC）途径和氨基已糖途径均是高糖条件下线粒体呼吸链中氧自由基生成过多导致的结果。氧化应激在糖尿病并发症发生中处于核心的角色。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitro-gen species，RNS）产生过多，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。糖尿病高血糖状态导致ROS和RNS生成增多，氧化应激反应增加［9］。一方面，氧自由基可攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化产物。神经髓鞘中含有大量脂类，体外试验表明在坐骨神经组织匀浆中加入20 mmo1/L葡萄糖，使脂质过氧化物增加超过4倍［10］。脂质过氧化产物的最终产物为MDA。脂质过氧化作用可放大ROS的作用，交联核酸、蛋白质及磷脂，也可使蛋白质巯基氧化，引起神经细胞进一步损伤［11］。另一方面，氧化应激反应可直接引发单链DNA的断裂，或通过JNK、P38信号转导通路诱导雪旺细胞中一系列半胱天冬酶激活，介导细胞凋亡的发生［12-13］。其中caspase-3在死亡受体和线粒体介导的经典细胞凋亡途径中均起着核心作用。由此可见氧化应激反应是糖尿病周围神经病变发病的重要机制，目前临床应用抗氧化剂α-硫辛酸治疗糖尿病周围神经病变，取得了较好疗效［14-15］。

本实验结果显示，补阳还五汤有与α-硫辛酸近似的作用，可使糖尿病周围神经病变大鼠神经传导速度增高，提升体内抗氧化剂SOD、GSH-Px、CAT活性，而使MDA水平及caspase-3活性明显下降，提示补阳还五汤能有效减低糖尿病周围神经病变大鼠的氧化应激损伤，发挥其保护作用。

补阳还五汤为清代医家王清任所创，配伍用量特点为君药黄芪剂量是其他活血通络药总和的5倍，《医林改错》中写到“黄芪用一二两，以后渐加至四两”，重用黄芪旨在令气旺血行而瘀去络通。为进一步探讨补阳还五汤配伍中重用黄芪的科学内涵，确定黄芪的最佳剂量，我们在实验中设置了黄芪60 g组和黄芪120 g组进行对比，结果显示黄芪60 g组与模型组比较神经传导速度、SOD、CAT活性均显著增高，MDA水平显著下降。黄芪120 g组与模型组比较除上述指标有如上变化外，GSH-Px活性显著增高，caspase-3活性明显下降。但不同黄芪剂量组间比较，除黄芪120 g组SOD活性较60 g组显著提高外，神经传导速度、GSH-Px、CAT活性有增高趋势，MDA水平及caspase-3活性有减低趋势，但差异无统计学意义。以上结果说明使用60 g黄芪的补阳还五汤就已经显示了较强的抗氧化作用，增大黄芪剂量可使其抗氧化效果略有增强，临床治疗时推荐按王清任原方120 g黄芪用量使用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0199-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.043

2013-11-01

河北省教育厅科学技术研究青年基金项目（QN2014019）

贲 莹（1979—），女，硕士，讲师，研究方向：中西医结合神经病学。Te1：13315989821，E-mai1：benyfortunate@sohu.com