UPLC指纹图谱法考察丹蛭降糖胶囊的不同制备工艺

庄星星，　杨晓旭，　魏良兵，　韩燕全，　高家荣，*

（1.安徽中医药大学药学院，安徽　合肥　230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽　合肥　230031）

UPLC指纹图谱法考察丹蛭降糖胶囊的不同制备工艺

庄星星1，杨晓旭1，魏良兵2，韩燕全2，高家荣1，2*

（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥230038；2.安徽中医药大学第一附属医院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031）

目的 运用超高效液相色谱（UPLC）法对两种制备工艺的丹蛭降糖胶囊特征指纹图谱进行初步研究比较，考察不同制备方法对药物指纹图谱的影响，为制备工艺的优化以及后续的药效学研究提供理论依据。方法 采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱；体积流量0.25 mL/min；柱温30℃；检测波长230 nm。结果 以芍药苷和丹皮酚为参照峰，新工艺（醇水双提）丹蛭降糖胶囊的特征指纹图谱共确定了15个共有峰，老工艺（水提）丹蛭降糖胶囊确定了12个共有峰。结论 丹蛭降糖胶囊新制备工艺特征指纹图谱确认的共有峰多，表明提取的有效成分多。对比指纹图谱的峰面积，新工艺峰面积明显高于老工艺，说明新工艺提取效率更高。

丹蛭降糖胶囊；UPLC指纹图谱；制备工艺

丹蛭降糖胶囊为安徽中医药大学第一附属医院院内制剂（皖药制字Z20090006），由太子参、生地黄、牡丹皮、菟丝子、泽泻、水蛭六味药物组成。具有益气养阴，活血化瘀之功效，临床主要用于治疗Ⅱ型糖尿病之气虚阴亏血瘀证及其慢性并发血管病变，疗效显著［1-3］。前期丹蛭降糖胶囊的制备工艺为水提法，并对其进行了指纹图谱研究［4］。2010年，丹蛭降糖胶囊获得国家“十二五”重大新药创制项目，对其制备工艺从新进行了研究。本实验采用超高效液相色谱（UPLC）法对新制备工艺（醇水双提法）生产的丹蛭降糖胶囊特征指纹图谱进行了研究，考察新老工艺的丹蛭降糖胶囊对药物主要有效成分的影响，并与老工艺的指纹图谱进行了比对，为工艺优化提供理论支持［5］。

1　仪器与试药

1.1仪器 Waters Acquity H-C1ass UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Acquity UPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；Acquity PDA检测器以及Waters Empower2软件；KQ3200DB型数控超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；有机相针式滤器（13 mm× 0.22μm）（上海安普科学仪器有限公司）；BP211D十万分之一天平（德国塞多利斯公司）；

1.2试药 芍药苷对照品（批号110736-200934，20 mg/支，纯度为94.9%）和丹皮酚对照品（批号0708-9704，20 mg/支，纯度为98.0%）均由中国食品药品生物研究院提供；丹蛭降糖胶囊（老工艺生产批号分别为20121125、20111217、20120107、20120221、20120315、20120409、20120503、20120527、20120618、20120715；新工艺生产批号分别为20120816、20120908、20121015、20121104、20121128、20121226、20130127、20130309、20130402、20130426）均由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供；乙腈、甲醇均为色谱纯，水为屈臣氏双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2　实验方法

2.1制备工艺

2.1.1醇水双提法制备工艺 处方中牡丹皮、泽泻药材加牡丹皮质量3倍量的95%乙醇浸泡0.5 h，90℃回流提取2 h，过滤，滤液在55℃减压浓缩至原体积1/20倍，保存；牡丹皮和泽泻提取后残渣与太子参、地黄和菟丝子三味药材及90%处方量水蛭加水浸泡0.5 h，煎煮提取2次，第1次加5倍量的水煎煮1.5 h，第2次加5倍量水煎煮1 h，分次滤过，合并滤液，滤液浓缩至原体积1/3，趁热缓缓加入浓缩液体积1.5倍量的95%乙醇，并不断搅拌，醇沉过夜。混匀后过滤，减压回收乙醇，真空干燥，干浸膏粉碎。剩余10%处方量的水蛭粉碎，加少量95%乙醇浸泡过夜后与牡丹皮和泽泻乙醇提取浓缩液合并。在乙醇提取浓缩液中加入适量糊精，55℃减压干燥，再与上述干浸膏粉末混合均匀，装胶囊，制成1 000粒，即得。

2.1.2水提取制备工艺 处方中六味药材，加水煎煮提取3次，第1次加10倍量水煎煮1.5 h，第2、第3次分别加8倍量水煎煮1 h。合并煎液，滤过，静置48 h，吸取上清液，减压浓缩至相对密度为1.2（60℃）的稠膏，真空干燥，干浸膏粉碎，加入糊精150 g，80%乙醇制粒，干燥（≤80℃），整粒，装入胶囊，制成1 000粒，即得。

2.2供试液制备 取两种工艺制备的丹蛭降糖胶囊内容物，研钵中研成粉末，精密称取0.5 g。加75%甲醇，25 mL，超声提取（150 W）30 min。超声提取后，冷却，补足失质量，滤过，滤液以0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液［6］。

2.3对照品制备 精密称取芍药苷对照品和丹皮酚对照品适量，制成混合液。以0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得对照品溶液。其中芍药苷质量浓度为0.256 mg/mL，丹皮酚为0.240 mg/mL。

2.4色谱条件 BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸，进行梯度洗脱，见表1；检测波长为230 nm；柱温35℃；体积流量为0.25 m L/min；进样量1μL［7］。

表1　丹蛭降糖胶囊UPLC特征指纹图谱流动相梯度洗脱程序

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验 同一批样品经“2.2”项供试液处理方法，按“2.4”项色谱条件，连续进样6次测定指纹图谱。使用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对测定的指纹图谱进行相似度评价，6次测定的指纹图谱相似度在0.99以上。各色谱图主要峰相对保留时间和峰面积的RSD均＜3%，均符合要求，表明仪器精密度好。

2.5.2稳定性试验 同一批样品经“2.2”项供试液处理方法，按“2.4”项色谱条件，在0、2、4、8、12、24 h进行进样，测定相应时间的指纹图谱。使用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对测定的指纹图谱进行相似度评价，6次测定的指纹图谱经相似度评价相似度在0.98以上，各色谱主要峰相对保留时间和峰面积的RSD均＜3%，表明供试液24 h内稳定。

2.5.3重复性试验 同一批样品经“2.2”项供试液处理方法，按“2.4”项色谱条件，进样测定6份供试液的指纹图谱。使用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对测定的指纹图谱进行相似度评价，6次测定指纹图谱经相似度评级相似度在0.98以上，各色谱主要峰相对保留时间和峰面积的RSD均＜3%，表明实验方法重复性好。

2.5.4空白试验 取适量75%甲醇，按色谱条件进样，结果说明空白溶剂对样品指纹图谱色谱峰无干扰，见图1。

图1　提取溶剂（75%甲醇）色谱图

3　两种工艺制备工艺丹蛭降糖胶囊的UPLC特征指纹图谱的建立及评价

3.1丹蛭降糖胶囊的UPLC特征指纹图谱的建立 分别取10批新老工艺的丹蛭降糖胶囊，按“2.2”项供试液处理方法平行处理。在“2.4”项色谱条件下，进样1μL，建立两种不同工艺的特征指纹图谱。将得到的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行色谱分析。水提取工艺制备的丹蛭降糖胶囊共有12个主要共有峰，醇水双提法制备的丹蛭降糖胶囊有15个主要共有峰。如图2、3所示。

图2　水提取制备工艺丹蛭降糖胶囊UPLC指纹图谱

图3　醇水双提制备工艺丹蛭降糖胶囊UPLC指纹图谱

3.2两种制备工艺UPLC特征指纹图谱的评价［3］以处方中君药牡丹皮中的主要有效成分丹皮酚和芍药苷为参照峰，比较两种制备工艺条件下丹蛭降糖胶囊UPLC特征指纹图谱的共有模式［8］，如图4所示。

图4　两种制备工艺条件下丹蛭降糖胶囊UPLC特征指纹图谱共有模式比较

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）分析比较两种工艺指纹图谱共有模式中各峰的峰面积［9］，见表2。其中7号峰为芍药苷，16号峰为丹皮酚。

表2　两组工艺共有模式特征指纹图谱峰面积比较

通过比较两种不同制备工艺所得的特征指纹图谱，醇水双提制备工艺生产的丹蛭降糖胶囊特征指纹图谱共有15个共有峰，水提制备工艺生产的丹蛭降糖胶囊特征指纹图谱有12个共有峰。表明醇水双提法对处方中有效成分的煎出明显优于水提取法。比较两种制备工艺的峰面积，醇水双提工艺组大部分峰的峰面积大于水提取工艺组［10］。比较参照峰的峰面积，醇水双提工艺组芍药苷和丹皮酚含量分别是水提工艺组的1.7倍和45.8倍。说明对于方中君药牡丹皮的主要成分提取效率，醇水双提的制备工艺是明显高于水提的制备工艺。

4　讨论

4.1参照物的选择 通过比较两种不同的提取工艺，结合实际实验情况，选择了牡丹皮中的芍药苷和丹皮酚为参照物。通过查阅相关的文献，发现丹皮酚水溶性差，水提法的提取率低，同时丹皮酚和芍药苷在降低血糖和治疗血管相关疾病方面有着广泛的药理作用［11-13］。所以选择丹皮酚和芍药苷为参照物。

4.2水提醇沉对指纹图谱的影响 通过比较两种不同制备方法生产的丹蛭降糖胶囊的特征指纹图谱，发现醇水双提组的峰面积普遍要比水提组高。分析原因可能是醇水双提组在水提取后加入了95%的乙醇进行水提醇沉，除去了不必要的杂质，提高了胶囊的实际载药率。因此在相同处理条件下，醇水双提组的有效成分含有量高于水提组。同时比较两组特征指纹图谱的共有模式（表2）发现14号峰的峰面积水提法明显大于醇水双提法。分析原因可能是某水溶性成分，在新工艺水提醇沉过程中有部分损失［14］。

本实验运用UPLC特征指纹图谱法对两种不同制备工艺的丹蛭降糖胶囊进行初步研究，水提取法制备的丹蛭降糖胶囊确定了12个共有峰，醇水双提法制备的丹蛭降糖胶囊确定了15个共有峰。通过比较两种工艺特质指纹图谱的共有模式，结合参照峰的峰面积，发现醇水双提的制备工艺在药材提取效率方面高于水提的制备工艺，为后续的丹蛭降糖胶囊后续的制备工艺优化和后续的药效学研究提供理论依据。

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R944

B

1001-1528（2015）01-0207-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.046

2013-11-12

国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题（JDZX2012003）；科技部重大新药创制项目（2010ZX09102-209）

庄星星（1990—），男，硕士生，研究方向：中药药剂新剂型。Te1：13696510131，E-mai1：zxx900913@126.com

高家荣（1964—），男，主任药师，硕士生导师，研究方向：中药制剂工艺和新药研发。Te1：（0551）62838556，E-mai1：zyfygjr2006@163.com