大孔吸附树脂富集纯化鹰嘴豆芽总异黄酮的工艺研究

高彦华，　罗玉琴，　马庆苓，　赛德艾合买提·吾拉木，　阿吉艾克拜尔·艾萨*

（1.中国科学院新疆理化技术研究所干旱区植物资源化学重点实验室，新疆　乌鲁木齐　830011；2.省部共建新疆特有药用资源利用国家重点实验室培育基地，新疆　乌鲁木齐　830011；3.中国科学院大学，北京　100049；4.新疆伊犁师范学院化学与生物科学系，新疆　伊宁　835000）

大孔吸附树脂富集纯化鹰嘴豆芽总异黄酮的工艺研究

高彦华1，2，3，罗玉琴1，2，马庆苓1，2，赛德艾合买提·吾拉木1，4，阿吉艾克拜尔·艾萨1，2*

（1.中国科学院新疆理化技术研究所干旱区植物资源化学重点实验室，新疆乌鲁木齐830011；2.省部共建新疆特有药用资源利用国家重点实验室培育基地，新疆乌鲁木齐830011；3.中国科学院大学，北京100049；4.新疆伊犁师范学院化学与生物科学系，新疆伊宁835000）

目的 研究大孔吸附树脂分离纯化鹰嘴豆芽总异黄酮的工艺参数。方法 以鹰嘴豆芽总异黄酮为考察指标，对8种大孔树脂采用静态吸附方法，优选出吸附解吸性能最佳的大孔树脂，并优化纯化条件，确定最佳工艺参数。结果HPD-300型树脂对鹰嘴豆芽总异黄酮有较好的吸附和解吸效果。其最佳纯化条件为：上样质量浓度3.05 mg/mL，上样体积4.5 BV，上样体积流量为2 BV/h；6 BV蒸馏水除杂后，继用5 BV20%乙醇洗脱除杂；洗脱剂95%乙醇，洗脱用量6 BV，洗脱体积流量2 BV/h。按此工艺条件验证试验，总异黄酮质量分数达到41.1%。结论 HPD-300型大孔树脂适合富集纯化鹰嘴豆芽总异黄酮。

鹰嘴豆芽；总异黄酮；大孔吸附树脂；纯化

豆科鹰嘴豆属Cicer植物全球共发现有44种，主要分布于亚洲西部和近中东地区，鹰嘴豆Cicer arietinum L是本属植物中唯一栽培成功、栽种面积较广的世界第三大食用豆类［1］。在我国的西部新疆鹰嘴豆已有2500年的栽培历史，是新疆维吾尔族民间药食兼用的植物，收载于《药品标准》（维吾尔分册）和《维吾尔药志》［2-3］。异黄酮类化合物是鹰嘴豆中报道较多的有效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、降低血液胆固醇、降低患糖尿病风险、改善心血管疾病、以及防治雌激素分泌失调引起的多种疾病等作用［4-6］。前期研究发现鹰嘴豆发芽后其豆芽中总异黄酮量能增长到原籽粒的数十倍之多；鹰嘴豆芽中异黄酮成分的种类也有很大的变化，其提取物在抗氧化活性方面有显著的提高［7-9］。大孔树脂是近年来被广泛应用于天然活性物质分离纯化的一种高聚物吸附剂，其具有吸附容量大、再生简单、使用周期长等优点［10］。目前，利用大孔树脂纯化黄酮、异黄酮的研究报道很多［11-12］，本实验针对8种不同型号的大孔树脂进行了富集纯化鹰嘴豆芽总异黄酮的筛选，确定了采用HPD-300型大孔树脂对鹰嘴豆芽总异黄酮富集纯化的工艺。

1　仪器与材料

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；Waters a11iance e2695高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XMT-DA电热恒温水浴锅（余姚市亚星仪器仪表有限公司）；恒振HZ系列全自动豆芽机（山东青州恒振豆芽机械有限公司）；Buchi R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；ESJ180-4电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）。鹰嘴豆芽素A（批号111708-200501）、芒柄花素（批号111703-200602）对照品购于中国药品生物制品检定所。大孔吸附树脂：HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-600、HPD-750（沧州宝恩化工有限公司）、D101（上海摩速科学器材有限公司）、AB-8（南开大学化工厂）、ADS-7（山东鲁抗医药股份有限公司）。

鹰嘴豆（卡布里）干燥种子于2012年9月采自新疆木垒县。鹰嘴豆种子在常温水中浸泡12 h后放入豆芽机中。在恒温、恒湿条件下生长96 h后摘取豆芽，室温下干燥。将干燥鹰嘴豆芽粉碎，过40目筛，得鹰嘴豆芽粉末，备用。

2　方法与结果

2.1吸附原液的制备 称取鹰嘴豆芽粉末，加20倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h，提取液过滤、减压浓缩至无醇味，备用。

2.2总异黄酮的测定

2.2.1线性关系考察 取60℃干燥至恒定质量的鹰嘴豆芽素A对照品适量，精密称定，加甲醇制成14.5μg/m L的对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。以甲醇为空白，在260 nm处测定吸光度（A）值，以A值（Y）对鹰嘴豆芽素A质量浓度（Ⅹ）进行线性回归，得回归方程Y=0.127 44Ⅹ+0.00 40 4，r=0.999 8，表明鹰嘴豆芽素A在1.45～8.7μg/mL的范围内，质量浓度与吸光度有良好的线性关系。

2.2.2方法学考察 通过精密度（RSD=0.27%），稳定性（3 h内，RSD=0.69%），重复性（RSD=0.96%）的考察，表明该方法对总异黄酮的测定稳定、可行。

2.2.3回收率考察 精密称取适量的豆芽粉末样品9份，分别加入一定量的鹰嘴豆芽素A对照品，按“2.1”项方法制备样品溶液，之后分别置100 mL量瓶中，用65%的乙醇溶解定容至刻度、摇匀。精密量取溶液2.5 mL至10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀后，在260 nm测定吸光度，计算样品总异黄酮含有量。计算回收率及RSD值，结果表明该方法回收率良好，见表1。

表1　回收率试验结果

2.2.4上柱液中总异黄酮的测定 取样品液稀释到一定质量浓度，按“2.2.1”项方法，在260 nm测定吸光值，计算样品液中总异黄酮的质量浓度。

2.3大孔吸附树脂型号的筛选

2.3.1大孔树脂的预处理与含水量的测定 取8种型号不同极性的新购大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h充分溶胀后装入玻璃色谱柱。用95%乙醇冲洗至流出的乙醇液与蒸馏水混合不出现白色浑浊。用大量的蒸馏水洗去乙醇，备用，各取1 g树脂采用干燥法测定含水量。

2.3.2静态吸附性能的考察 分别精密称取处理好的8种大孔吸附树脂，每份相当于相应干树脂1.00 g置于50 mL锥形瓶中，精密加入吸附原液20 mL，震荡吸附24 h，充分吸附后，过滤，测定滤液中总异黄酮的量，计算各种树脂的比吸附量（Qe）及吸附率（E）。

C0为样品溶液中总异黄酮质量浓度，V0为样品溶液体积，C1为吸附平衡后溶液中总异黄酮的质量浓度，V1为吸附平衡后溶液体积，m为树脂质量（g）。

将吸附饱和的大孔树脂置50 mL瓶中，加入95%乙醇40 mL，密塞，震荡24 h，充分解吸后，测定解吸液中总异黄酮的量，计算各种树脂的解吸量及解吸率。

解吸量=解吸液中总异黄酮的质量/m

解吸率=解吸液中总异黄酮的质量/树脂中吸附的总异黄酮质量

由表2结果可知，在静态吸附饱和状态下，ADS-7型树脂对鹰嘴豆芽总异黄酮的吸附量较大，HPD-300、HPD-600、HPD-100次之。在静态洗脱中，HPD-300型树脂吸附的总异黄酮洗脱量最大。因此综合饱和吸附量和洗脱量两项指标，选用HPD-300型吸附树脂富集纯化鹰嘴豆豆芽总异黄酮。

2.4HPD-300大孔树脂对鹰嘴豆芽总异黄酮动态吸附―洗脱参数考察

2.4.1上样液总异黄酮质量浓度对动态吸附的影响 准确称取经预处理的HPD-300树脂5 g（相当于干质量），湿法装柱，共6份。配制不同质量浓度的鹰嘴豆芽总异黄酮水溶液，保持上样液总异黄酮量相同（117.8 mg）。以2 BV/h的体积流量上柱吸附，用6 BV蒸馏水3 BV/h的体积流量除去杂质，收集过柱残液和水洗液，测定总异黄酮，计算比吸附量及吸附率，结果见表3。可知当鹰嘴豆芽浓缩液总异黄酮质量浓度为3.05 mg/mL时，HPD-300树脂对其吸附能力最好。因此，确定3.05 mg/mL为最佳上样浓度。比吸附量=（上样液总异黄酮量-过柱液质量浓度×过柱液体积-水洗液质量浓度×水洗液体积）/树脂质量

2.4.2上样体积流量对动态吸附的影响 准确称取经预处理的HPD-300树脂6.2 g（V=33 mL），湿法装柱。取100 mL上样液，分别以1、2、3、4 BV/h的体积流量上样吸附；5 BV/h蒸馏水、3 BV/h的体积流量洗脱除杂，收集过柱残液和水洗液，测定其中总异黄酮量，计算树脂动态吸附量分别为45.73、44.42、44.11、43.61 mg/g。结果表明，上样流量慢时，树脂的吸附量较大，但所需用的时间较长，为了提高效率，确定最佳上样流量为2 BV/h。

表3　不同上样液质量浓度对动态吸附的影响

2.4.3泄露曲线的绘制 按上述所确定的吸附条件，准确称取处理好的HPD-300大孔树脂6.2 g（V=33mL，径高比1∶6），湿法装柱，进行动态吸附实验。分段收集流出液，每份10 mL，共收集26份。以测定鹰嘴豆芽总异黄酮质量浓度为考察指标，绘制泄露曲线，结果见图1。可以看出，当上样体积超过150 mL，即上样体积达到4.5 BV后，流出液总异黄酮质量浓度为0.608 5 mg/mL，相当于上柱液质量浓度的1/5，达到了泄露点质量浓度［13］。继续增加上样量，流出液中总异黄酮大量泄漏，为了避免上样液过多泄漏，确定最大上样体积为4.5 BV。

图1　HPD-300树脂动态吸附曲线

2.4.4洗脱剂乙醇体积分数的确定 准确称取经处理的HPD-300树脂6.2 g，湿法装柱。按照最佳吸附条件上样吸附后，先用蒸馏水以2 BV/h的体积流量除杂至流出液为无色，再依次用4 BV一定体积分数的乙醇上柱洗脱，收集各洗脱液，检测其中总异黄酮量，并对不同体积分数乙醇洗脱部位中已知异黄酮进行HPLC跟踪分析。浓缩洗脱液、真空干燥至恒定质量，计算总异黄酮质量分数，结果见表4。可以看出，60%乙醇洗脱部位总异黄酮质量分数较高，通过HPLC分析95%乙醇洗脱样品中已知2种异黄酮含有量较高。而20%乙醇洗脱部分，总浸膏量较多，总异黄酮含有量较少，因此为了优化大孔树脂纯化的效果，提高纯化目标物的纯度，选用蒸馏水除杂后，再用20%的乙醇除杂，收集95%乙醇洗脱部分。

表4　不同洗脱剂对总异黄酮解吸的影响

2.4.5冲洗杂质所用溶媒体积分数的考察 准确称取经处理的HPD-300树脂6.2 g，湿法装柱，共6份。按照最佳吸附条件上样吸附后，用蒸馏水（6 BV）洗脱至无色。分别用1、2、3、4、5、6 BV体积分数为20%乙醇以2 BV/h的体积流量洗脱杂质，之后用6 BV 95%乙醇以2 BV/h洗脱，收集洗脱液，检测并计算洗脱液中总异黄酮的量，减压浓缩干燥，恒定质量，计算总异黄酮质量分数，结果见表5。由结果可知，用20%乙醇洗脱可以提高纯化物中总异黄酮的质量分数，超过5 BV后对总异黄酮影响不明显，使用过多20%乙醇洗脱会损耗纯化物中总异黄酮的量。因此，综合考虑，选5 BV的20%乙醇洗脱除杂用量。

表5　不同体积20%乙醇除杂用量考察

2.4.6不同洗脱体积流量对洗脱曲线及解吸量的影响 准确称取经处理的HPD-300树脂6.2 g，湿法装柱，共4份。按照最佳吸附条件上样吸附后，分别用6 BV蒸馏水、5 BV 20%乙醇除杂。之后用95%乙醇，分别以1、2、3、4 BV/h体积流量进行动态解吸实验。每20 mL收集一份，测定解吸液中总异黄酮的量，绘制洗脱曲线，比较不同洗脱流量对洗脱曲线及解吸量的影响。由图2可以看出，以1、2 BV/h体积流量洗脱时，洗脱曲线峰型集中，无明显拖尾现象，解吸量差异不大。而以3、4 BV/h体积流量洗脱时，洗脱峰变矮，洗脱峰向后拖延，解吸量也较1、2 BV/h体积流量洗脱时低。约6 BV洗脱体积后，洗脱液中总异黄酮含有量已经很低。综合考虑洗脱效果和解吸量，确定2 BV/h流量，6 BV的95%乙醇洗脱较合理。

图2　HPD-300型树脂洗脱曲线

2.5最佳工艺稳定性试验 根据上述实验结果，按最佳实验条件操作。取质量浓度为3.05mg/mL的鹰嘴豆芽提取液150 mL，以2 BV/h体积流量上样，依次用蒸馏水6 BV、20%乙醇5 BV除杂；再用95%乙醇6 BV洗脱，洗脱液，测定总异黄酮的量。浓缩干燥、恒定质量，并计算浸膏中总异黄酮的质量分数，计算总异黄酮的回收率。平行3份，结果显示总异黄酮的质量分数为41.1%，回收率71%。可以看出经HPD-300树脂纯化后，鹰嘴豆芽总异黄酮的出膏率明显降低，质量分数达到40%以上。

3　讨论

3.1鹰嘴豆是为数不多的含有如芒柄花素（formononetin）、鹰嘴豆芽素A（biochanin A）、芒柄花苷（ononin）、印度黄檀苷（Sissotrin）等几种特殊异黄酮的日常食用的豆类［14-15］。鹰嘴豆通过发芽自然生长的过程是一种富集总异黄酮的方法，也有文献报道使用大孔吸附树脂来分离纯化发芽后的鹰嘴豆中总异黄酮，但因为鹰嘴豆豆瓣中的油脂成分含有量较高，提取浓缩液的水溶性较差，导致大孔吸附树脂容易堵塞、吸附及洗脱难以进行［16］。本实验是选用鹰嘴豆发芽后含异黄酮量较高的芽部位进行提取，本部位提取浓缩液的水溶性较好，大孔吸附树脂富集纯化总异黄酮时不会产生堵柱现象，使大孔树脂富集纯化总异黄酮工艺能顺利进行、树脂重复利用性良好。

3.2本实验考察8种大孔吸附树脂对鹰嘴豆芽总异黄酮进行静态吸附筛选，结果表明HPD-300型弱极性树脂具有较好静态吸附及解吸效果。针对HPD-300型树脂进行了吸附、解吸工艺条件的优化，纯化工艺为：最佳上样质量浓度为3.05 mg/mL的豆芽提取水溶液，以2 BV/h体积流量上样，体积4.5 BV；吸附饱和后，依次用6 BV蒸馏水、5 BV20%乙醇洗脱除杂；用95%乙醇6 BV洗脱，收集洗脱液浓缩、干燥，即得经HPD-300型大孔树脂纯化的鹰嘴豆芽总异黄酮富集纯化部位。鹰嘴豆芽提取液中总异黄酮的质量分数从6.1%提高到41.1%，洗脱率达到80%。该工艺稳定可行，为大生产提供了科学参考价值。

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R284.2

B

1001-1528（2015）01-0216-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.049

2013-10-15

新疆维吾尔自治区科技计划项目（201110110）

高彦华（1980—），女，博士生，主要从事天然产物研究。Te1：（0991）3836733，E-mai1：gechoao@126.com

阿吉艾克拜尔·艾萨（1965—），男（维吾尔族），博士，研究员，主要从事民族药学研究。Te1：（0991）3835679，E-mai1：haji@ms.xjb.ac.cn

日期：2014-03-28

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140328.1044.001.htm1