槲皮素对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏者红细胞的体外氧化作用

陈 丽　董金涛

（1 广州市白云区人民医院药剂科，广东 广州 510500；2 广州市白云区第一人民医院，广东 广州 510080）

槲皮素对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏者红细胞的体外氧化作用

陈 丽1董金涛2

（1 广州市白云区人民医院药剂科，广东 广州 510500；2 广州市白云区第一人民医院，广东 广州 510080）

目的 探讨槲皮素对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏者红细胞氧化还原状态的影响。方法 分别在体外将低、中、高浓度的槲皮素与G6PD缺乏者及正常者的40%红细胞悬液和全血进行孵育，然后测定红细胞还原性谷胱甘肽（GSH））及高铁血红蛋白（MetHb）水平的变化。结果槲皮素具有较强氧化作用，能明显降低G6PD缺乏者红细胞GSH水平，升高MetHb，且这种氧化作用呈一定浓度依赖性，在中、高浓度表现明显。结论槲皮素对G6PD缺乏者红细胞具有氧化作用，G6PD缺乏者应慎用含槲皮素成分的食物、中草药及制剂。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏；槲皮素；氧化作用；还原性谷胱甘肽；高铁血红蛋白

槲皮素是一种具有多种生物活性黄酮类化合物［1］，属于黄酮类化合物中的黄酮醇，可保护机体免受活性自由基的侵害，广泛存在各种食物、化学药物及100种中草药中，如水果、酒、茶、刺五加、银杏叶等。近期研究显示槲皮素也具有氧化作用，同时可导致红细胞凋亡和氧化损伤。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种常见的遗传性疾病，也是世界上最多见的红细胞酶病，据统计全球约有近4亿人G-6-PD缺陷，给社会和家庭带来了沉重的经济负担。我国分布规律呈“南高北低”的态势，长江流域以南，尤以广东、海南、四川等地为高发区，发生率为4%～15%，个别地区高达40%。本病是由于调控G-6-PD的基因突变所致，包括伯氨喹啉型药物性溶血性贫血或蚕豆病，感染诱发的溶血，新生儿黄疸等，其中新生儿黄疸和溶血性贫血为其主要临床表现［2］。那么G6PD缺乏者是否可接触槲皮素类药物及含槲皮素类食物呢？迄今尚无文献报道。本实验分别在体外将低、中、高浓度的槲皮素与G6PD缺乏者及正常者的40%红细胞悬液和全血进行孵育，然后测定红细胞还原性谷胱甘肽（GSH）及高铁血红蛋白（MetHb）水平的变化，为G6PD缺乏者安全使用槲皮素提供依据。

1　材料与方法

1.1研究对象（研究方案报医院伦理委员会审批并签订知情同意书）：①收集于我院住院的G6PD缺乏患者15例，入选标准：G6PD活性活性＜6.7 U/gHb；男性，年龄18～60岁，无其血液系统疾病。②招募健康正常人15例，入选标准：G6PD活性活性＞6.7 U/gHb；年龄18～60岁，血常规及肝肾功能检查正常；无溶血、感染性疾病病史，无其他血液系统疾病，愿意配合完成试验。

1.2材料与仪器：槲皮素（98.5%、批号：201906-202602）购自Sigma Aldrich公司；α-萘酚（纯度≥96%批号：1542551，2500815）购自Sigma Aldrich公司；二甲基亚砜（DMSO）购自广州化学试剂公司、G-6-PD缺乏症诊断试剂盒（批号：20120803）购自广州科方医疗、谷胱甘肽试剂盒（批号：201200816）购自南京建成生物工程研究所、血红蛋白试剂盒（批号：20200925）购自上海科欣生物技术研究所；7170A全自动生化分析仪购自日立公司；UV-2550紫外可见分光光度计购自岛津公司；sysmex XE-2100全自动血细胞分析仪。

1.3试剂的配备二甲基亚砜（DMSO）：配成1、5、10 mol/L储备液；α-萘酚：用DMSO配制成0.4 mmol/L储备液，临用前将各储备液用5 mmol/LPBS稀释成50%备用。

1.4方法

1.4.1样本采集采集肘静脉处血液2～3 mL置于内含EDTA真空管内（BD公司生产）；为防止溶血的发生，于常温下1～2 h内或4 ℃冰箱内可延长至4 h内进行处理；使用离心机分离血清，条件为4 ℃，3000 rprn，10 min；④为防止重复实验过程中反复冻融导致蛋白质损失，将血清分装至三个管内，冻存于-80 ℃冰箱内。⑤采血后12 h之内要完成血常规、G6PD活性测定、肝肾功能及药物体外孵育试验。

1.4.2G6PD活性测定：①EDTA-K2抗凝血以4000 r/min离心5 min，避开血浆层准确吸取压积红细胞20 μL加入1 mL溶解液溶解，待红细胞完全溶解后（约1～2 min）上机测定；②参数设定：试剂（1）220 μL，试剂（2）25 μL；试验温度37 ℃；主/副波长340/660 nm；反应时间10 min；计算因数209084，结果以U/L表示。应用全自动血细胞分析仪测定Hb（g/L），取EDTA-K2抗凝血2 mL，进样量约200 μL。最终，G6PD活性=G-6-PD（U/L）/Hb（g/L），结果以U/gHb表示。

1.4.3药物体外孵育试验全血离心后，分离血浆和白细胞层。压积用4 ℃ PBS洗涤3次后，以40%体积重新悬浮于PBS中制备40%红细胞悬液；加入槲皮素使终浓度为50、250、500 μmol/L；同时设立α-萘酚组（0.02 mg/mL）、DMSO组（5%）和PBS组；孵育管置于37 ℃水浴中，振荡孵育2 h。同时，将未处理的全血直接与药物孵育，药物终浓度及对照组的设置同上。

表1　α-萘酚、DMSO、PBS对红细胞GSH和MetHb的影响（，n=10）

表1　α-萘酚、DMSO、PBS对红细胞GSH和MetHb的影响（，n=10）

注：与正常者比较，aP＜0.05，bP＜0.001；与DMSO组比较，cP＜0.001与40%红细胞悬液中比较

孵育体系　组别　α-萘酚组　DMSO组　PBS组GSH（mg/dLRBC）　MetHb/%　GSH（mg/dLRBC）　MetHb/%　GSH（mg/dL RBC）　MetHb/% 40%红细胞悬液　缺乏者　28.1±4.6c　7.59±1.8　37.7±6.5b　0.52±1　34.3±6.4b　0.59±1.2正常者　49.6±6.5　4.88±2.5c　52.2±7.3　0.42±1.3　50.3±6.3　0.51±1.4全血　缺乏者　27.9±7.7cd　2.65±1.8ce　31.9±7.7b　0.76±1.5　35.8±7.8b　0.79±1.2正常者　54.6±6.9　1.77±1.4　55.5±6.6　0.71±1.5　53.6±6.5　0.83±0.5

1.4.4GSH及MetHb测定孵育后的血样离心（2000 r，10 min），取红细胞以1∶2500比例加入纯化水中制备溶血液。区溶血液用比色法对GSH进行定量测定；溶血中MetHb以加入氰化钾前后630 nm处吸收光度的差值作为定量依据，测定MetHb所占比。

1.5统计分析：应用SPSS13.0统计分析软件对实验数据进行分析，数据以均值±标准差表示。两组间的比较采用两独立样本t检验进行分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1受试者一般情况：G6PD缺乏组G6PD活性（0.3±0.39）U/gHb，正常组（13.8±2.5）U/gHb， G6PD缺乏组G6PD活性显着低于正常组，差异有统计学差异（P＜0.05）。

2.2α-萘酚及DMSO对红细胞GSH和MetHb的影响；把实验分为α-萘酚组、DMSO组和对照组，分别用α-萘酚、DMSO和PBS进行干预。结果显示，α-萘酚组和DMSO组中，G6PD缺乏者及正常者红细胞的GSH和MetHb存在明显差异，差异具有统计学差异，P＜0.05。见表1。

2.3不同浓度的槲皮素对正常者及G6PD缺乏者的红细胞GSH和MetHb的影响（，n=15）。在40%红细胞悬液中，低浓度槲皮素对正常的红细胞GSH水平无影响，MetHb稍增高，没有明显差异（P＞0.05），中、高浓度对G-6-PD缺乏者红细胞GSH活性明显下降（P＜0.001），而MetHb水平明显上升（P＜0.001）。见表2。

表2　40%红细胞悬液中槲皮素对G-6-PD缺乏者正常红细胞GSH和MetHb的影响

2.4全血中不同浓度的槲皮素对正常者及G6PD缺乏者的红细胞GSH和MetHb的影响。槲皮素对G6PD正常红细胞GSH水平无影响，MetHb水平稍增高，但增高无明显差异，对G-6-PD缺乏者红细胞GSH活性水平明显下降（P＜0.01），MetHb水平明显上升（P＜0.001）。见表3。

表3　全血中不同浓度的槲皮素对正常者及G6PD缺乏者的红细胞GSH和MetHb的影响

3　讨　论

槲皮素为五羟黄酮，其分子中2、3位间有双键，37、47位处有2个羟基故具有能作为金属螯合作用或油脂等氧化过程中产生的游离基团接受体的功能，可作为油脂、抗坏血酸的抗氧化剂。

槲皮素的功能研究主要侧重于其抗氧化作用，但槲皮素对体内红细胞的氧化作用则知之甚少，尤其对G6PD缺乏者。另外，红细胞的氧化性损伤具有累积效应，也就是说长期使用一些强化剂，累积到一定程度后会发生溶血反应等。因此应全面了解槲皮素功能。由此可见了解槲皮素对体内红细胞的氧化作用具有重要的意义。目前关于槲皮素对红细胞氧化作用机制尚未明确，有的认为槲皮素亲脂性较大，可通过细胞膜而直接氧化Hb；有的认为其含黄酮醇形成的不稳定酚自由基或自氧化产物具有氧化作用，对G6PD缺乏者由于没有足够抗氧化物质，槲皮素极易造成红细胞损伤。

抗氧化物质、脂质及蛋白等物质会富含于正常人的血浆中，从而保证了在全血中的红细胞不易被氧化。因此正常人使用含槲皮素食物不易产生这些氧化作用。据报道红细胞的压积与其对抗氧化物损害的能力密切相关，红细胞的压积大小与其损失程度呈反比。因此本实验设置40%红细胞悬液孵化体系。表1显示α-萘酚干预组G6PD缺乏者发生溶血性贫血，红细胞水平显着降低，MetHb水平明显升高；而对G6PD正常者GSH水平无影响，但红细胞MetHb升高，因为体外高铁血红蛋白在体外无递氢体亚甲蓝参与不能还原。至于槲皮素的试验浓度（50、250、500 μmol/L）是根据以下依据设定的：参考其他相关研究中槲皮素应用的浓度、结合临床可能达到浓度范围，经预实验设定。

结果显示，槲皮素的氧化作用与其浓度密切相关，呈一定浓度依赖性，中浓度下已可对G6PD缺乏者红细胞造成较大的氧化性损伤，高浓度下这一损伤更明显（P＜0.001）。在食物中，所含槲皮素量少，G6PD缺乏者饮食摄入量不至于对其红细胞造成损伤。另外，在常用中药材或口服液中，由于槲皮素的含量较高，G6PD缺乏者要慎用。

本实验通过体外试验考察了槲皮素对G6PD缺乏者红细胞的氧化作用，我们把实验分为α-萘酚组、DMSO组和对照组，分别用α-萘酚、DMSO和PBS进行干预，结果显示，α-萘酚组和DMSO组中，G6PD缺乏者及正常者红细胞的GSH和MetHb存在明显差异，差异具有统计学差异。有报道称槲皮素、黄芩素等9中黄酮类可不同程度地增加G6PD缺乏者红细胞的氧化性压力，造成了一定氧化性损伤，这给我们临床用药带来了很大的启示，也就是说对于G6PD缺乏者来说槲皮素、芹菜素等9中黄酮类是要谨慎使用的。G6PD缺乏症是新生儿病理性黄疸的主要原因。因此，对于G6PD缺乏者的新生儿、儿童来说，要谨慎使用大剂量应用富含槲皮素的中草药和中草药制剂［4］。

［1］谭君，王伯初，祝连彩.槲皮素金属配合物的药理作用研究进展［J］.中国药学杂志，2006，41（22）:1688-1691.

［2］常富兴，汤林华.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的研究进展［J］.国际医学寄生虫病杂志，2007，34（3）:128-129.

［3］谭毅菁，招钜泉.两种检测方法对G6PD活性检测的比较［J］.中国医学工程，2012，20（2）:68-69.

［4］吴彤华，朱元昌.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因诊断方法的建立［J］.临床检验杂志，2014，32（4）:188-192.

Effect of Quercetin on Red Blood Cells Lack of Glucose -6-phosphate Dehydrogenase in Vitro

CHEN Li1， DONG Jin-tao2
（1 Department of Pharmacy， Baiyun District People's Hospital of Guangzhou， Guangzhou 510500， China； 2 The First People's Hospital of Baiyun District Guangzhou， Guangzhou 510080， China）

Objective To study the effect of quercetin on REDOX state of red blood cells lack of glucose-6-phosphate dehydrogenase （G6PD）. Methods In vitro incubation， low， medium and high concentration of quercetin， respectively cultured with G6PD deficient and normal red blood cells， red blood cell suspension at 40% and in whole blood， to detect the reducing glutathione（GSH） and methemoglobin （MetHb） levels of red blood cells. Results Quercetin is of strong oxidation， can significantly reduce the GSH level of G6PD deficient erythrocyte， elevate MetHb level. This oxidation was of concentration dependence，especial performance in the medium and high concentration of quercetin. Conclusion Quercetin is of oxidation on the red blood cells lack of G6PD.The patients with G6PD deficient should be careful with food，herbal medicine and pharmaceutics containing quercetin composition.

Lucose-6-phosphate dehydrogenase； Quercetin； Oxidation； Reducing glutathione； Methemoglobin

R446.1

B

1671-8194（2015）16-0014-02