奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定

籍芳，孙玉慧，李天宝，*，王春利，刘炜，李文斌

（1.江门出入境检验检疫局，广东江门529000；2.北京迪马科技有限公司，北京100000）

奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定

籍芳1，孙玉慧1，李天宝1，*，王春利1，刘炜1，李文斌2

（1.江门出入境检验检疫局，广东江门529000；2.北京迪马科技有限公司，北京100000）

建立了同时测定奶粉香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的超高效液相色谱法。样品用水溶解后使用ProElut PXA固相萃取柱进行样品前处理净化，C18柱分离，超高效液相色谱仪进行色谱分析。结果表明，香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素在0.5 mg/L～20 mg/L范围内线性关系良好；方法的检出限（S/N=3）分别为0.20、0.25、0.25 mg/L；添加水平在2.5 mg/L～10.0 mg/L时加标回收率为80.3%～102.7%，相对标准偏差为1.85%～4.11%（n=6）。该方法结果准确可靠，可实现奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的快速同步分析。

固相萃取；超高效液相色谱；奶粉；香兰素；甲基香兰素；乙基香兰素

香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素均是重要的食用香料，用途十分广泛，通常在食品、日化、烟草工业中作为香原料、矫味剂或定香剂，其中饮料、糖果、糕点、饼干、面包和炒货等食品用量居多，另外还可做饲料的添加剂、电镀行业的增亮剂、制药行业的中间体。研究表明，大剂量食用可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝、肾。根据GB 2760-2011《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》要求，凡使用范围涵盖0至6个月婴幼儿配方食品，不得添加任何食用香料。

目前，文献报道测定香兰素的方法有紫外分光光度法［1-2］、高效液相色谱法［3-8］、电化学法［9］、荧光分光光度法［10］、气相色谱-质谱联用法［11-13］。但鲜见固相萃取结合超高效液相色谱法测定奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的研究报道。本文通过优化样品的净化和分离条件，建立了同时测定奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的超高效液相色谱方法，以期为保证奶粉质量和人体健康提供技术支持。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；3-30K型冷冻离心机：德国Sigma公司；R-210型旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司。

香兰素标准品（纯度≥99.0%，CAS No.121-33-5）：环境保护部环境标准研究所；甲基香兰素标准品（纯度≥99.0%，CAS No.120-14-9）：环境保护部环境标准研究所；乙基香兰素标准品（纯度≥99.0%，CASNo.121-32-4）：环境保护部环境标准研究所；甲醇，乙酸，乙腈（色谱纯）：美国Tedia公司；SPE固相萃取柱（ProElut PXA 150 mg/6 mL）：北京迪马科技有限公司；有机系微孔滤膜（孔径0.45 μm）：天津津腾实验设备有限公司。

标准储备溶液配制：准确称取香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素标准品，分别用乙腈配制成1.0 mg/mL的单标储备液；

混合标准溶液配制：吸取一定体积的单标储备液用50%乙腈水溶液配制成0.1 mg/mL的混合中间液。

1.2奶粉样品

本文选用4种国产品牌和4种进口品牌共8个品牌的婴幼儿奶粉，均购自本地大型超市，留作加标试验和实际样品测定试验。

1.3样品前处理

取1.0 g奶粉于25 mL离心管中，加入20 mL水混匀，振摇5 min，8 000 r/min下离心2 min；取出10 mL上清液，待净化。

依次向固相萃取柱中加入6 mL甲醇和6 mL水，流出液弃去，固相萃取柱活化完毕。将待净化液加入经活化的固相萃取柱中，流出液弃去；再用6 mL 20%甲醇水淋洗，流出液弃去；向柱中加入6 mL 5%乙酸甲醇溶液，收集流出液；将流出液在45℃下减压蒸至完全干燥，用50%乙腈水定容至1 mL后上UPLC分析。

1.4色谱条件

色谱柱：EndeavorsilC18柱，1.8μm，100mm×2.1mm；流动相：乙腈+0.02 mol/L醋酸铵溶液=8+92（体积比，用醋酸调pH=3.5）；流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；进样量：2 μL；检测器：紫外检测器；检测波长：280 nm。

2　结果与讨论

2.1样品净化条件的优化

由于奶粉基质比较复杂，蛋白质含量较高，需要在前处理过程对目标物进行净化、富集。因此，本方法采用经过活化的固相萃取柱ProElut PXA对奶粉样品溶液进行进化处理，达到对目标物质香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素净化、富集的目的，处理后的溶液直接使用超高效液相色谱仪进行测定。实验证明，该法操作简单，净化效果好，加标回收率大于80%，可以满足各种奶粉中的香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素日常检测要求。

2.2液相色谱条件的选择

2.2.1检测波长的选择

香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的特征吸收峰主要为229、278、308、279和309 nm，本文选择280 nm作为检测波长，结果目标物质分离效果好、峰形对称。

2.2.2流动相选择

分别以乙腈+0.02 mol/L醋酸铵溶液=8+92，乙腈+ 0.02 mol/L醋酸铵溶液=20+80，乙腈+0.02 mol/L醋酸铵溶液=35+65，乙腈+0.02 mol/L醋酸铵溶液=5+95作为流动相进行实验，结果当流动相为乙腈+0.02 mol/L醋酸铵溶液=8+92，并用醋酸调pH=3.5时，香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的保留时间分别为7.1、16.8、18.1 min，分离效果好，峰形对称。

2.3线性范围与检出限

用流动相稀释制备浓度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列浓度标准溶液，按优化色谱条件进行测定。结果表明，在香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的浓度为0.5 mg/L～20.0 mg/L时，色谱峰面积（A）与其质量浓度（ρ）间呈良好线性关系，线性方程分别为A= 7 331.5ρ+253.4（r2=0.999 7）、A=6 034.6ρ+35.56（r2= 0.999 7）和A=5 373.7ρ-716.25（r2=0.999 8）。以S/N=3确定本方法的检出限，得到香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的检出限分别为0.20、0.25、0.25 mg/L。

2.4回收率与精密度

采用加标回收法，以不含香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的奶粉为空白样品基质，在2.5 mg/kg和10.0 mg/kg的回收率及相对标准偏差（RSD）见表1。

从表1中可以看出，香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的回收率分别为80.3%～102.7%、82.9%～100.5%和80.6%～90.6%，RSD分别为2.22%～3.43%、3.90%～4.11%和1.85%～2.81%。图1、图2和图3分别为标准溶液、加标样品溶液以及空白样品溶液的液相色谱图。

表1　香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素加标回收率与相对标准偏差Table 1Recoveries and RSDs for vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin

图1　香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素混标色谱图Fig.1Chromaograms of mixed standard solution

图2　香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素加标色谱图Fig.2Chromaograms of spiked blank sample

图3　香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素空白色谱图Fig.3Chromaograms of blank sample

2.5实际样品的分析

随机抽取本地超市销售的4个国内品牌和4个进口品牌共8种婴幼儿配方奶粉，按照本文建立的方法进行检测，均未检出香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素。

3　结论

由于奶粉基质比较复杂，所以需要在前处理过程对目标物净化、富集。本文所建立的奶粉中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素检测方法，使用ProElut PXA进行样品前处理净化，有效去除蛋白质等干扰物质，净化效果优异；超高效液相色谱柱Endeavorsil C18进行色谱分析，可实现香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的快速完全分离，结果准确可靠。

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Determination of Vanillin，Methyl Vanillin and Ethyl Vanillin in Milk Powder

JI Fang1，SUN Yu-hui1，LI Tian-bao1，*，WANG Chun-li1，LIU Wei1，LI Wen-bin2
（1.Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jiangmen 529000，Guangdong，China；2.Dikma Technologies Incorporation，Beijing 100000，China）

An ultra performance liquid chromatography（UPLC）method was developed for the simultaneous determination of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in milk powder.Samples were dissolved with water，purified with solid phase extraction column，separated with C18column，and determined with ultra performance liquid chromatography.The results showed that there were good linear relationships between peak areas and concentrations of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in the range of 0.5 mg/L-20 mg/L，with limits of detection of 0.20 mg/L，0.25 mg/L and 0.25 mg/L，respectively.The recoveries at spiked levels of 2.5 mg/L-10.0 mg/L were in the range of 80.3%-102.7%，with the relative standard deviations（RSDs，n=6）of 1.85%-4.11%.The method was sensitive and reliable，and could achieve the fast simultaneous analysis of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in milk powder.

solid phase extraction；Ultra performance liquid chromatography；milk powder；vanillin；methyl vanillin；ethyl vanillin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.022

2014-05-08

广东省科技计划项目（2011B010400019）；国家质检总局科技计划项目（2014IK169）

籍芳（1979—），女（汉），工程师，硕士研究生，主要研究方向：进出口商品检验。

李天宝（1981—），男（汉），高级工程师，硕士研究生，主要研究方向：进出口商品检验。