不同提取方法对鲜食大豆荚膳食纤维抗氧化特性的影响

赵　丽，宋一茉，朱丹实，惠丽娟，王　勃，何余堂，马　涛，刘　贺（渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013）

不同提取方法对鲜食大豆荚膳食纤维抗氧化特性的影响

赵丽，宋一茉，朱丹实，惠丽娟，王勃，何余堂，马涛，刘贺*
（渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013）

以鲜食大豆荚为原料，通过碱法、酶法、超声辅助酶法及微波辅助酶法提取水溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维，测定其总黄酮含量、还原能力、DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力以研究其抗氧化特性，并与市售大豆膳食纤维作比较。结果表明，各种方法提取的鲜食大豆荚膳食纤维的总黄酮含量及抗氧化特性均高于市售大豆膳食纤维，鲜食大豆荚水溶性膳食纤维的抗氧化特性高于不溶性膳食纤维，酶法、超声和微波处理能提高鲜食大豆荚膳食纤维的抗氧化特性。

鲜食大豆荚，膳食纤维，抗氧化

鲜食大豆也称毛豆或菜用大豆，是指在大豆鼓粒中后期，荚色呈鲜绿时采收食用或加工用的大豆总称［1］。鲜食大豆中富含优质蛋白，多种不饱和脂肪酸及卵磷脂，可预防高血压、脑中风、心脏病等［2］。此外维生素、矿物质含量也很丰富，是兼具营养与保健双重功能的食品，深受消费者喜爱［3］。鲜食大豆荚是鲜食大豆子实脱壳后的副产物，不仅含有大量膳食纤维，还含有天然抗氧化物质，如类黄酮化合物等［4］。目前鲜食大豆荚常常被当作饲料或废料丢弃，不仅经济效益低，浪费资源，也造成了环境污染。

膳食纤维（dietary fiber，DF）是指在人体内难以被小肠内源酶消化的碳水化合物或其类似物，可分为水溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）。膳食纤维可有效降低人体罹患癌症、糖尿病、心血管疾病、胃肠道疾病以及肥胖病的风险；同时膳食纤维还具有改善食品品质，延长食品货架期，增强食品生理功能等作用［5］。

近几年来，围绕膳食纤维抗氧化活性研究逐渐成为热点，其清除自由基作用越来越受到研究者的关注。因为合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚（BHA）或多或少具有一些安全性问题，所以抗氧化膳食纤维作为一种有潜力的抗氧化剂，在许多食品中已有应用，能够部分取代合成抗氧化剂的作用［6］。欧仕益通过实验证明，SDF和IDF都有清除自由基的功效，起作用的主要是DF中含有的多酚类物质［7］。目前尚未见到鲜食大豆荚膳食纤维抗氧化特性的研究报道。本文以鲜食大豆荚为原料，用不同方法提取鲜食大豆荚膳食纤维，并研究了其对体外抗氧化特性的影响，以期为鲜食大豆荚膳食纤维功能性食品的开发提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

东北有机大豆朝阳本色有机食品有限公司提供；市售大豆膳食纤维陕西慈缘生物技术有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） 美国Sigma公司；芦丁标准品阿拉丁试剂有限公司；α-淀粉酶（3000 U/g）、中性蛋白酶（70000 U/g）北京鸿润宝顺科技有限公司；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸、硫酸亚铁等均为分析纯。

UV-2550紫外分光光度计日本岛津公司；SL-250A高速多功能粉碎机浙江省永康市松青五金厂；L-535R离心机长沙湘仪离心机有限公司；RE3000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；SK6210HP超声波清洗器上海科导超声仪器有限公司；格兰仕WD800G型微波炉顺德市格兰仕微波炉电器有限公司；DHG-9055A电热鼓风干燥箱、DK-8D电热恒温水槽上海一恒科技有限公司；AR224CN电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；PHS-3C精密pH计上海雷磁仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1鲜食大豆荚膳食纤维的制备

1.2.1.1碱法鲜食大豆荚20 g→干燥粉碎→加入25倍体积水→用NaOH调pH12.0，碱解1 h→3000 r/min离心20 min→过滤→滤液→真空浓缩→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［8］。↓

滤渣→干燥→IDF

1.2.1.2酶法鲜食大豆荚20 g→干燥粉碎→加入25倍体积水→调pH6.0→1%α-淀粉酶50℃酶解30 min→调pH7.0→1%中性蛋白酶50℃酶解30 min→灭酶→3000 r/min离心20 min→过滤→滤液→真空浓缩→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［9］。↓

滤渣→干燥→IDF

1.2.1.3超声辅助酶法鲜食大豆荚20 g→干燥粉碎→加入25倍体积水→调pH6.0→加1%α-淀粉酶→超声波处理100W，50℃，30min→调pH7.0→1%中性蛋白酶50℃酶解30min→灭酶→3000 r/min离心20 min→过滤→滤液→真空浓缩→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［10］。 ↓

滤渣→干燥→IDF

1.2.1.4微波辅助酶法鲜食大豆荚20 g→干燥粉碎→加入25倍体积水→调pH6.0→加1%α-淀粉酶→微波处理320 W，50℃，30 min→调pH7.0→1%中性蛋白酶50℃酶解30 min→灭酶→3000 r/min离心20 min→过滤→滤液→真空浓缩→4倍乙醇沉淀24 h→干燥→SDF［11］。 ↓

滤渣→干燥→IDF

1.2.2抗氧化活性成分的提取与测定

1.2.2.1抗氧化活性成分的提取取2 g鲜食大豆荚膳食纤维及大豆膳食纤维样品，用70%乙醇溶液，料液比1∶50（g/mL），于70℃恒温水浴锅中浸提6 h［12］，抽滤后取滤液定容至100 mL。

1.2.2.2总黄酮含量的测定采用Al（NO3）3法测定［13］，稍作改动。分别取0.2 mg/mL的芦丁标准液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，用体积分数70%的乙醇补足体积至10 mL，加50 g/L亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min；加100 g/L硝酸铝溶液1.0 mL，混匀，放置6 min；加200 g/L氢氧化钠溶液4.0 mL，再加70%乙醇至25 mL，摇匀，放置15 min。以试剂空白调节零点，在波长510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁的质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。以样品提取液的吸光度通过标准曲线计算其总黄酮含量。

1.2.3抗氧化活性的测定

1.2.3.1还原能力的测定采用Oyaizu［14］的方法，略加改动，取0.2 mL样品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾，于50℃水浴20 min后快速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，取2.5 mL此溶液加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3，静置10 min后于波长700 nm处测定吸光度，以市售大豆膳食纤维为参照。吸光度越高，抗氧化性越好，表明还原能力越强。

1.2.3.2DPPH自由基清除能力的测定按照Shimada等［15］的方法进行。取2 mL提取液置于反应管中，加入0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2 mL，混匀后室温避光反应30 min，以2 mL 70%的乙醇与2 mL无水乙醇混合物为空白，在517 nm处测定其吸光度，以市售大豆膳食纤维为参照。按照下式计算清除率，清除率越大，抗氧化能力越强。

式中：A1—样品组；A2—样品对照组（无水乙醇代替DPPH）；A0—模型对照组（70%的乙醇代替样品液）。

1.2.3.3羟自由基清除能力的测定采用Fenton反应体系模型［16］，试管中按顺序加入2 mL 6 mmol/L水杨酸－无水乙醇、2 mL 6 mmol/L FeSO4、1 mL稀释50倍的样品液、0.1 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37℃水浴30 min，以蒸馏水作为空白，于波长510 nm处测定吸光度，以市售大豆膳食纤维为参照。按照下式计算清除率，清除率越大，抗氧化能力越强。

式中：A1—样品组；A2—样品对照组（蒸馏水代替H2O2）；A0—模型对照组（70%的乙醇代替样品液）。1.2.4统计分析实验数据平行测定3次，结果以表示，采用Origin（OriginPro 8.6.0 SR1）软件作图，应用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，差异显著性水平为p＜0.05。

2　结果与分析

2.1总黄酮含量

总黄酮含量标准曲线方程：y=0.4666x－0.0096，R2=0.9981。式中：y为吸光度，x为芦丁的质量/（mg）。黄酮类是通过酚羟基与自由基R·反应，形成共振稳定半醌式自由基结构，从而终止自由基反应，实现抗氧化作用［17］。一些研究表明样品的抗氧化性大多随着总黄酮、异黄酮等含量增加而增加［18］。因此，它可初步评价样品是否具有抗氧化性。鲜食大豆荚膳食纤维及市售大豆膳食纤维中总黄酮含量见图1。

图1　总黄酮含量测定结果Fig.1　Total flavonoid content in different samples

由图1可知，各种方法提取的鲜食大豆荚膳食纤维中总黄酮含量均高于市售大豆膳食纤维，鲜食大豆荚水溶性膳食纤维中总黄酮含量比不溶性膳食纤维高。经酶法提取、超声处理、微波处理后的膳食纤维中总黄酮含量均较碱法有所提高，其中酶法提取SDF和IDF总黄酮含量的总量最高，两者之和达到5.27 mg/g，因为酶法能有效去除原料中淀粉、蛋白质等物质，提高膳食纤维中黄酮类物质含量［12］。

2.2还原能力

还原能力的测定是以样品是否为良好的电子供体为指标，还原能力大的样品是良好的电子供体，其供应的电子不仅能使Fe3+还原成Fe2+，同时能与自由基反应，使自由基成为较为稳定的物质，从而中断自由基连锁反应［19］。鲜食大豆荚膳食纤维及市售大豆膳食纤维的还原能力见图2。

图2　还原能力的测定结果Fig.2　Reducing power of different samples

由图2可知，还原能力与总黄酮含量呈正相关（r=0.946），酶法能显著地提高水溶性膳食纤维的还原能力（p＜0.05），达到0.407，其还原能力较市售大豆膳食纤维提高了89.3%，微波辅助酶法提取SDF还原能力（0.394）次之。对于不溶性膳食纤维，微波辅助酶法提取IDF还原能力最高，达到0.323，与超声辅助酶法IDF没有显著性差异（p＞0.05）。微波萃取的机制是细胞内极性成分如水吸收了微波能后压力迅速增加导致细胞结构的破坏［20］，最终影响其还原能力，但是，需要进一步研究确定抗氧化机制。

2.3DPPH自由基清除能力

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，被广泛用于测定待测样品对自由基的清除能力。待测样品向DPPH自由基转移电子或氢原子，使其转变成稳定的分子1，1-二苯基-2-苦味酰肼。其乙醇溶液由紫色变成黄色，颜色变浅的程度代表清除DPPH自由基能力的大小［21-23］。鲜食大豆荚膳食纤维及市售大豆膳食纤维清除DPPH自由基的能力见图3。

图3　DPPH自由基清除能力测定结果Fig.3　DPPH radical scavenging ability of different samples

由图3可知，清除DPPH自由基能力与总黄酮含量呈正相关（r=0.801），各种方法提取的鲜食大豆荚膳食纤维清除DPPH自由基的能力较市售大豆膳食纤维都有很大提高，其中超声辅助酶法提取SDF清除能力最高，达到87.37%，是市售大豆膳食纤维的3倍多，酶法提取SDF清除能力（86.49%）次之，两者无显著性差异（p＞0.05）。对于不溶性膳食纤维，超声辅助酶法提取IDF清除能力最高，达到78.16%，微波辅助酶法提取IDF（74.47%）次之。超声提取的膳食纤维中含有较多的C-H键和游离羟基［24］，导致膳食纤维供氢能力增加，清除DPPH自由基的能力增大。由此可见，鲜食大豆荚膳食纤维是一种良好的DPPH自由基清除剂。

2.4羟自由基清除能力

·OH是毒性最强的活性氧，可直接损坏生物膜，导致一系列疾病的产生和辐射损伤。它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损伤，特别是嘧啶和嘌呤［22］。它的大量产生是中毒的重要特征，因此清除羟自由基是预防各种疾病的有效途径［25］。鲜食大豆荚膳食纤维及市售大豆膳食纤维清除羟自由基的能力见图4。

图4　羟自由基清除能力测定结果Fig.4　Hydroxyl radial scavenging ability of different samples

由图4可知，清除·OH能力与总黄酮含量呈正相关（r=0.919），酶法提取SDF对·OH的清除率最高（p＜0.05），为34.04%，较碱法SDF提高了62.48%；超声辅助酶法提取SDF对·OH的清除作用也很大，达到了26.46%。对于不溶性膳食纤维，酶法提取IDF清除能力最高，达到22.76%，较碱法IDF提高了38.27%；超声辅助酶法提取IDF（21.90%）次之，两者无显著性差异（p＞0.05）。说明超声法和酶法都能有效地清除·OH，其糖基上特别是糖醛酸分子中的活跃羟基能够与·OH结合生成水从而清除自由基，而碱法能中和膳食纤维分子中的糖醛酸分子生成盐，从而降低其抗氧化活性［24］。

3　结论

3.1各种方法提取的鲜食大豆荚膳食纤维的总黄酮含量及抗氧化特性均高于市售大豆膳食纤维，鲜食大豆荚水溶性膳食纤维的抗氧化特性高于不溶性膳食纤维，酶法、超声处理、微波处理的鲜食大豆荚膳食纤维中总黄酮含量较碱法均有不同程度的增加，并且均提高了还原能力、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力等抗氧化能力。

3.2鲜食大豆荚膳食纤维具有一定的抗氧化活性，有可能作为功能性食品基料添加到面包、饼干、糕点等食品中，既可增加食品中膳食纤维的含量，又可以起到抗氧化的作用。但是，鲜食大豆荚膳食纤维中起到抗氧化作用的成分，以及各种成分的种类和含量差异，还有待进一步的研究。

［1］王新华.豫东地区鲜食大豆无公害高产栽培技术［J］.大豆科技，2014（3）：45-47.

［2］董友魁，付连舜，单维奎.辽宁省鲜食大豆产业发展的可行性分析［J］.大豆科技，2014（3）：11-13.

［3］张圣平，刘世琦，谷卫刚，等.菜用大豆荚果发育过程中主要营养组分的变化［J］.山东农业大学学报，2005，36（1）：97-100.

［4］王莹，王桃云，钱玮，等.大豆荚壳营养成分分析与评价［J］.大豆科技，2011（2）：27-28，31.

［5］赵丽，李倩，朱丹实，等.膳食纤维的研究现状与展望［J］.食品与发酵科技，2014，50（5）：76-82，86.

［6］牛广财，朱丹，肖盾，等.花红可溶性膳食纤维的抗氧化活性［J］.食品科学，2011，32（19）：100-103.

［7］张玉倩，赵乃峰，王成忠，等.膳食纤维功能特性与改性的研究［J］.粮食加工，2010，35（5）：57-59.

［8］李昊虬.果蔬副产物膳食纤维提取工艺的研究［D］.包头：内蒙古科技大学，2012.

［9］Zhu F M，Du B，Li R F，et al.Effect of micronization technology on physicochemical and antioxidant properties of dietary fiber from buckwheat hulls［J］.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2014，3（3）：30-34.

［10］苗敬芝，冯金和，董玉玮.超声结合酶法提取生姜中水溶性膳食纤维及其功能性研究［J］.食品科学，2011，32（24）：120-125.

［11］何传波，魏好程，熊何健，等.酶与微波处理对海带多糖提取及抗氧化活性的影响［J］.食品科学，2013，34（18）：51-55.

［12］周小理，钱韻芳，周一鸣，等.不同处理工艺对苦荞麸皮膳食纤维体外抗氧化活性的影响［J］.食品科学，2011，32（8）：1-4.

［13］李涛，刘晓璠，杨小兰.啤酒花总黄酮测定方法的比较研究［J］.食品科学，2014，35（18）：89-92.

［14］Oyaizu M.Studies on products of browning reaction：antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine［J］.Japanese Journal of Nutrition，1986，44（6）：307-315.

［15］Shimada K，Fujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrinemulsion［J］.JournalofAgriculturalandFood Chemistry，1992，40（6）：945-948.

［16］Smirnoff N，Cumbes Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes［J］.Phytochemistry，1989，28（4）：1057-1060.

［17］石秀梅，雷激，梁爱华，等.3种来源膳食纤维抗氧化特性比较［J］.食品科技，2013，38（1）：71-75.

［18］Lopez-Vargas J H，Fernandez-Lopez J，Perez-Alvarez J A，et al.Chemical，physico-chemical，technological，antibacterial and antioxidant propertiesof dietary fiber powder obtained from yellow passion fruit（Passiflora edulis var.flavicarpa）co-products［J］. Food Research International，2013，51（2）：756-763.

［19］赵晶，马丹雅，张筠，等.酪蛋白与还原糖美拉德反应产物抗氧化性的研究［J］.食品工业科技，2011，32（12）：187-189，293.

［20］李怡杰，陆海南，覃江克，等.微波辅助提取油茶枯中膳食纤维的工艺优化［J］.食品科技，2013，38（5）：188-192.

［21］Ajila C M，Aalami M，Leelavathi K，et al.Mango peel powder：A potential source of antioxidant and dietary fiber in macaroni preparations［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2010，11（1）：219-224.

［22］温志英，杨丽钦.花生壳水溶性膳食纤维微波辅助提取工艺及其性质研究［J］.中国粮油学报，2011，26（4）：99-103.

［23］Chen Y，Xie M Y，Nie S P，et al.Purification，composition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma atrum［J］.Food Chemistry，2008，107（1）：231-241.

［24］徐学玲.大豆膳食纤维的超声提取及性质研究［D］.合肥：合肥工业大学，2010.

［25］邵娟娟，马晓军.豌豆皮膳食纤维吸附性质和抗氧化性质的研究［J］.食品工业科技，2011，32（8）：157-159，163.

Effect of different extraction methods on antioxidant properties of dietary fiber from vegetable soybean pods

ZHAO Li，SONG Yi-mo，ZHU Dan-shi，HUI Li-juan，WANG Bo，HE Yu-tang，MA Tao，LIU He*
（College of Food Science and Technology，Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，China）

The antioxidant properties of soluble and insoluble dietary fiber from vegetable soybean pods extracted with alkali，enzymes，ultrasonic-assisted-enzymes and microwave-assisted-enzymes were studied in this paper.For the antioxidant properties，the total flavonoid content，reducing power，the scavenging ability to DPPH radical and the scavenging ability to hydroxyl radical were determined，compared with commercial soybean dietary fiber.The results showed that the total flavonoid content and the antioxidant properties of dietary fiber from vegetable soybean pods were higher than dietary fiber from commercial soybean.The antioxidant properties of soluble dietary fiber from vegetable soybean pods were higher than insoluble dietary fiber.Enzymes，ultrasonic treatment and microwave treatment could improve the antioxidant properties of dietary fiber from vegetable soybean pods.

vegetable soybean pods；dietary fiber；antioxidant properties

TS209

A

1002-0306（2015）20-0155-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.024

2015－01－20

赵丽（1990－），女，在读硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：xiaoni900509@163.com。

刘贺（1979－），男，博士，教授，研究方向：食品大分子的结构与功能及其修饰，E-mail：liuhe2069@163.com。

国家自然科学基金面上项目（31471621）；国家自然科学基金青年基金项目（31201385）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划（LR2014034）。