大鼠激素性股骨头坏死的2种造模方法比较*

赵振广，潘树义，李航

（1.中国人民解放军医学院，北京100853；2.中国人民解放军海军总医院高压氧医学中心，北京100048）

大鼠激素性股骨头坏死的2种造模方法比较*

赵振广1，2，潘树义1，2，李航2

（1.中国人民解放军医学院，北京100853；2.中国人民解放军海军总医院高压氧医学中心，北京100048）

目的比较不同地塞米松用药方案腹腔注射建立大鼠激素性股骨头坏死模型的可靠性及成功率，为大鼠激素性股骨头坏死模型的建立方法提供基本数据。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为A组、B组、C组，各10只。A组给予地塞米松磷酸钠注射液20 mg/（kg·d）腹腔注射，1次/周；B组给予地塞米松磷酸钠注射液10 mL/（kg·d）腹腔注射，2次/周；C组给予0.9%氯化钠注射液20 mL/（kg·d）腹腔注射，1次/周；均持续8周。于首次给药8周末摄双髋正位X线检查，次日处死取双侧股骨头标本，行组织形态学检查。结果A、B、C 3组大鼠股骨头双髋正位X线检查均未发现异常，但在病理切片上可发现显著性差异，证实激素性股骨头坏死造模成功，而B组股骨头坏死改变较A组明显严重。结论腹腔注射地塞米松20 mg/（kg·d），1次/周，持续8周的方案和地塞米松10 mL/（kg·d），2次/周，持续8周的方案均能成功建立大鼠激素性股骨头坏死的早期模型，但后一种造模方案更优。

股骨头坏死；激素；地塞米松；大鼠；动物试验

随着糖皮质激素在临床工作中的大量应用，目前激素性股骨头缺血性坏死（SANFH）已成为非创伤型股骨头坏死的首要病因［1-2］，该病进展迅速，如不能采取有效干预手段，将很快进入不可逆的病理进程，且缺乏有效根治方法［3］。有关激素引起股骨头坏死的学说很多，然而其确切机制和始动环节仍未明了，因此，建立理想的股骨头坏死的动物模型，是研究SANFH发病机制和早期诊治的重要手段。本研究中拟采用长期地塞米松小剂量腹腔注射的方法，比较不同地塞米松用药方案的造模效果，为大鼠早期SANFH模型的成功建立提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试药

健康雄性4月龄Wistar大鼠（军事医学科学院提供，合格证编号：SCXK-＜军＞2012-004）30只，体重（0.21±0.01）kg，将大鼠分6笼，每笼5只，饲养于海军总医院实验动物中心，自由饮水进食，饲养条件一致，所喂养的颗粒饲料由海军总医院实验动物中心提供。地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司，国药准字H41020036）；水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，国药准字H37022673）；多聚甲醛及10%EDTA脱钙液（自配）。AXIOM Aristos MX型西门子X线摄影成像系统（海军总医院影像科提供）；动物固定架（自制）；RM2235石蜡切片机、LEICA DM500三目生物显微镜及图像信号采集与分析系统（德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及分组

所有大鼠适应性喂养1周后，电子称称重并编号，采取随机数字表法将35只大鼠分为3组，各10只。A组给予地塞米松磷酸钠注射液20 mg/（kg·d）腹腔注射，1次/周；B组给予地塞米松磷酸钠注射液10 mL/（kg·d）腹腔注射，2次/周；C组为空白对照组，给予0.9%氯化钠注射液20 mL/（kg·d）腹腔注射，1次/周；均持续8周。

1.2.2 大体观察X线检查

主要观察试验动物体重变化、步态、毛发光泽度及动物股骨头大体形态。于距首次注射8周末，全部动物水合氯醛麻醉，摄双髋正位X线片。

1.2.3 病理组织学检查

X线检查后1 d，采用放血处死法，固定动物，取双侧股骨头，将所取标本按动物编号分别置多聚甲醛溶液中固定2 d，然后置10%EDTA缓冲液中脱钙，每周更换脱钙液1次，持续2个月后通过探针检测判断脱钙完全。将脱钙后的股骨头常规脱水、透明、包埋制成蜡块，沿纵面剖开，切片行HE染色。光学显微镜下观察骨髓组织、骨小梁、成骨细胞及骨细胞的形态数量变化，并计算空骨陷窝率。

1.3 统计学处理

应用CHISS 7.0统计软件分析，计量数据用均数±标准差表示，以P＜0.05为检验水准，进行单因素方差分析，进一步分析采用SNK-q检验法，如数据不符合正态分布或组间方差不齐，则采用秩和检验分析。

2 结果

2.1 大体观察

3组动物均无意外死亡，未见明显步态异常。A组及B组可见毛发杂乱，缺少光泽并伴有明显消瘦，且B组消瘦更明显（表1），C组大鼠体型正常。3组动物股骨头外观均晶莹光滑，肉眼观察无明显差异。

2.2 X线检查结果

3组动物行髋关节正位X线检查，结果均无异常，见图1。

2.3 病理组织学观察

选取股骨头软骨下区域作为主要观察视野。C组标本骨小梁排列规整，连续性好，骨髓组织含量丰富，正常形态骨细胞及成骨细胞在视野中多见，骨细胞空陷窝罕见；B组标本均出现骨小梁稀疏、变细，甚至断裂或被疏松结缔组织包绕分解成云片状，结构紊乱，骨髓组织坏死多见，视野中成骨细胞稀少，骨细胞核固缩、边聚甚至消失形成空骨陷窝；A组标本亦出现轻微股骨头坏死征象，骨髓组织有坏死，但总体含量较B组丰富，骨小梁亦有稀疏、变细现象，但明显轻于B组，可见成骨细胞，空骨陷窝少见。见图2。在高倍镜下任意选取10个视野，计数形态完全正常的骨细胞数量和空骨陷窝细胞数量，并计算空骨陷窝率，以判断股骨头坏死程度，结果见表2。可见，3组间正常形态骨细胞数量及空骨陷窝率两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 3组大鼠喂养8周后体重大小比较

图1 大鼠双髋正位X线片

图2 病理组织学观察（HE×100）

表2 3组股骨头切片正常形态骨细胞数量对比（±s）

表2 3组股骨头切片正常形态骨细胞数量对比（±s）

组别A组B组C组切片数（张）20 20 20正常形态骨细胞数量（个）17.5±2.24*▲11.7±2.30*31.0±5.15空骨陷窝率（%）12.0±2.16*▲16.5±2.53*7.3±1.25

3 讨论

关于如何获得一个经济可靠的SANFH动物模型，学术界进行的研究很多，然而想得到3期以上的激素性股骨头坏死模型却十分困难，分析主要有以下2个原因：其一，动物对激素的耐受性与人类不同，如白兔对激素耐受性差，大鼠则相反，注射剂量小易导致造模失败，而剂量大又会引起试验动物大量死亡；其二，四足动物与人类股骨头解剖上区别明显，激素之所以在人类容易引起股骨头坏死不仅是因为局部血管解剖因素，作为负重关节，机械应力的原因亦不可忽视，而在四足动物，股骨头处的负重显然要小得多，此类模型一般仅出现股骨头坏死的早期表现，且坏死区域在股骨头少见，反而干骺端更多见［4］。理论上，早期SANFH的动物模型更易获得，但实际造模成功率并不高。

Kuribayashi等［5］尝试用肌肉注射甲基强的松龙的方式建立兔SANFH模型，注射剂量为20 mg/（kg·d）。结果显示，1个月后股骨头坏死的发生率为70%，但有20%的试验动物在肌肉注射甲基强的松龙后死亡；Takao等［6］使用同样的剂量造模，却以失败告终，仅观察到股骨近端干骺端的骨髓坏死；Zhang等［7］则采用皮下注射的方式给予家兔甲基强的松龙，剂量为21 mg/（kg·d），1个月后，有80%的家兔可观察到股骨头坏死发生。Yang等［8］在建立鼠SANFH模型中使用了2种不同方案，给药方式为在饮水中加入地塞米松，2种方案均在第1周加入地塞米松4 mg/（L·d）。持续给药组从第2周起给药剂量改为2 mg/（L·d），间断给药组则仅在每周中的后3.5 d给予4 mg/（L·d），2种方法总给药量相同，持续12周后的观察结果提示，持续给药组骨坏死的发生率为45%，显著高于间断给药组的8%。Kerachian等［9］将泼尼松缓释微丸植入大鼠皮下，平均释放剂量相当于1.82～2.56 mg/（kg·d），为期90 d，成功观察到骨细胞的凋亡。

根据以上研究可推测，在总激素量不变的情况下，增加给药频率，激素所产生的不良反应更明显，因而股骨头坏死发生率及坏死程度更重，符合临床上所行“激素间断性给药”方案研究结果［10］。本研究中采取了2种给药模式进行造模来验证这一推测，参考前文提及的Yang等［8］试验中的总给药剂量，本研究中同样采用地塞米松进行造模，给药方式为腹腔注射，A组和B组总注射剂量相同。参考大量学者的试验研究，选定8周作为时间节点来判定造模效果。结果显示，A、B两组大鼠均有明显消瘦，且B组大鼠体重减轻更明显，推测更高的给药频率产生的不良反应更强。病理切片结果提示，虽然A、B两组大鼠均有骨髓坏死，正常形态骨细胞数量减少等早期骨坏死改变，但B组在股骨头组织病理切片上损害更严重，骨髓坏死的面积也有更大趋势。

一般认为，骨坏死的病理改变主要为骨髓组织坏死并伴有骨小梁中空骨陷窝增多，可见弥散性的骨细胞核固缩［11］，本试验中A、B两组的病理结果均与之相符。根据目前应用最广泛的激素性股骨头缺血性坏死国际骨循环研究学会1991分期，其中0期的表现为，X线片、核磁共振、骨扫描检查均无异常，但在行病理学检查时可发现股骨头内组织坏死；Ⅰ期表现为，X线片正常，但核磁共振和骨扫描可发现异常，此期股骨头形态无异常，病理切片上可观察到坏死灶与正常活骨界限明显。本试验中未行核磁共振及骨扫描检查，但根据X线检查及病理切片结果认为，A、B两组大鼠均符合0期SANFH的改变，且B组造模方案空骨陷窝率更高，骨细胞坏死更明显，较A组更优。此外，二者在病理上的结果均提示早期SANFH中已存在骨细胞死亡，成骨细胞减少的现象。成骨细胞是参与骨修复的最主要细胞，已有研究表明，激素对成骨细胞有明显的抑制作用。Smith等［12］曾报道激素可调节细胞周期来影响成骨细胞增殖，还有研究发现激素可促进成骨细胞凋亡［13］，可推测激素在破坏股骨头骨细胞的同时还通过抑制成骨细胞减慢其修复反应，使得激素性股骨头坏死中的修复反应非常微弱。因此，打破坏死、修复之间的平衡可能是激素导致早期骨坏死发生的机制之一，也正是由于修复速度赶不上破坏速度，使得骨坏死不断进展，最终发展到晚期的股骨头塌陷。

本研究的不足之处在于，所得到的动物模型仅有早期骨坏死改变，造模方案操作简单，用时较短，动物均无死亡，且组内大鼠在病理切片的表现上呈均一性反应，其中B组方案的动物模型骨坏死改变更明显，将该动物模型应用于试验研究中效果更佳，可对深入研究SANFH的发病机制及早期干预措施起到积极的推动作用，值得在科研中推广运用。

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Comparison of 2 Rat Modelling Methods of Glucocorticoid-Induced Avascular Necrosis

Zhao Zhenguang1,2,Pan Shuyi1,2,Li Hang2
（1.Medical School of PLA,Beijing,China100853；2.Department of Hyperbaric Oxygen,The Navy General Hospital of PLA, Beijing,China100048）

ObjectiveTo compare the reliability and success rate of the different intraperitoneal injection of dexamethasone regimen in glucocorticoid-induced avascular necrosis in rats model，and provide the basic data for setting up rat models of steroid-induced avascular necrosis of femoral head.Methods30 male Wistar rats were randomly divided into group A（10）and group B（10），group C（10）.Group A was given dexamethasone sodium phosphate injection 20 mg/（kg·d），1 time/week for 8 weeks；group B was given dexamethasone sodium phosphate injection 10 mL/（kg·d），2 times/week for 8 weeks；group C was given 0.9%chloride 20 mL/（kg·d），1 time/week for 8 weeks.ResultsNo abnormalities were found in double hip X-ray examination of the three groups，but significant differences can be found on pathological section，the differences confirmed that building hormone osteonecrosis is successful and the degree of femoral head necrosis of Group B is more serious than group A.ConclusionBoth methods（intraperitoneal injection of dexamethasone，20 mg/（kg·d），1 time/week，for 8 weeks andintraperitoneal injection of dexamethasone，10 mL/（kg·d），2 times/ week，for 8 weeks）can successfully established early stage rat models of glucocorticoid-induced avascular，and the latter method is better than the previous one.

femoral head necrosis；glucocorticoid；dexamethasone；rat；animal experiment

R965；R332

A

1006-4931（2015）20-0016-03

赵振广，硕士研究生，主治医师，研究方向为高压氧医学；潘树义，博士研究生，主任医师，研究方向为高压氧医学，本文通讯作者，（电子信箱）psy9992011@163.com。

2015-03-30）

*北京市自然科学基金资助项目，项目编号：7154241；全军医学科技青年培育项目，项目编号：13qnp075。