富血小板血浆对老龄犬纤维多孔钛颈椎椎间融合器沉降的影响

曹师锋，谢宁，宋鑫，赵振国，倪明，焦鲲，尹伟忠

基础研究

富血小板血浆对老龄犬纤维多孔钛颈椎椎间融合器沉降的影响

曹师锋，谢宁，宋鑫，赵振国，倪明，焦鲲，尹伟忠

目的观察富血小板血浆（PRP）对老龄比格犬颈椎前路椎间融合术纤维多孔钛椎间融合器（FPT Cage）沉降的影响。方法选取6只7～9岁、12.5～15.0 kg的健康比格犬（雌雄各3只）作为实验动物。取比格犬前肢外周静脉血，采用二次离心法制备PRP，同时对外周静脉血及PRP进行血小板计数。行颈椎前路C4/5、C5/6椎间盘切除、FPT Cage椎间融合术，单纯使用未浸泡PRP的FPT Cage行C4/5椎间融合，采用浸泡激活后的PRP复合FPT Cage融合C5/6，术后4个月处死实验犬后行X线片及Micro-CT检查，观察C4/5、C5/6椎间融合器的沉降情况。结果C4/5节段有4例出现不同程度的椎间融合器沉降，另2例出现Cage向前移位；C5/6节段未有椎间融合器发生沉降，仅1例出现Cage向前移位。结论复合PRP可减少老龄比格犬颈椎椎间融合术FPT Cage的沉降。

富血小板血浆；血小板活化；骨质疏松；颈椎；脊柱融合术；椎间融合器；钛；沉降；显微CT；狗

伴随着人口的老龄化进程，骨质疏松颈椎病患者的手术治疗成为目前的研究焦点。目前公认的标准术式是1955年Robinson和Smith［1］提出的颈椎前路椎间隙减压椎间融合术式，自体髂骨融合效果最为确切，但因存在供区相关并发症，临床应用受到限制。椎间融合器的应用为颈椎融合术提供了新的选择，不少研究显示，单纯应用椎间融合器即可获得确切疗效，同时还减少了钛板植入带来的相关并发症及应力遮挡，减轻患者的经济负担［2］。

随着椎间融合器的迅速发展和广为应用，融合器移位、沉降、邻近部位骨吸收等相关并发症的报道也逐渐增多。如何针对患者自身情况选择合适的椎间融合器，将对融合效果及手术结局产生重要影响［2］。目前适用于骨质疏松老年患者的椎间融合器研究较少。纤维多孔钛（fiber porous titanium，FPT）是近年来出现的一种孔隙率均匀的多孔金属支架材料，其相互连通的三维多孔结构使融合器具有骨传导性，弹性模量及生物力学特性亦适用于老年骨质疏松患者。但是，多孔钛支架存在生物活性欠佳、骨长入较慢等缺陷，骨质疏松患者使用时仍存在椎间融合器沉降的可能［3-6］，需要通过椎间融合器表面生物改性，即复合生物活性成分或固定生物活性分子，来增强其骨诱导性能，促进椎间融合，进而达到减少椎间融合器沉降的目的［5-6］。本实验旨在通过观察复合富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）对老龄犬颈椎前路椎间融合术FPT椎间融合器（FPT Cage）沉降的影响，为骨质疏松患者椎间融合器的改良提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康实验用比格犬6只，雌雄各3只，由上海中医药大学动物实验中心提供［实验动物许可证编号：SCXK（沪）2012-0005］，年龄7～9岁，平均年龄为8.1岁；体质量12.5～15.0 kg，平均体质量为13.8 kg。

主要实验试剂：4%枸橼酸钠抗凝剂（四川南格尔生物科技有限公司），戊巴比妥钠（西安沃尔森生物技术有限公司），无水CaCl2（西陇化工股份有限公司），凝血酶冻干粉（上海第一生化药业有限公司），0.85%生理盐水（上海远慕生物科技有限公司），头孢拉定胶囊（上海福达制药有限公司），0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（上海经科化学科技有限公司），10%多聚甲醛溶液（苏州市第二化工研究所有限责任公司）。主要实验器材：真空采血管（成都瑞琦科技实业有限公司），一次性使用无菌注射器（上海凯乐输液器厂），电子台秤（上海兴澄衡器有限公司），电子天平（美国Strtorius公司），TDL-80-2B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），YB-DX23D电动吸引器（上海医疗器械工业集团公司医用吸引器厂），－80°低温冰箱（日本Sanyo公司），XE2100全自动血细胞分析仪（日本Sysmex公司），Skycan 1076显微CT扫描机（比利时Skycan制造公司）。

1.2 FPT Cage

图1 纤维多孔钛棒与纤维多孔钛椎间融合器1A大尺寸纤维多孔钛棒大体照片1B纤维多孔钛椎间融合器1C具有良好韧弹性的高强韧性纤维多孔钛材料

本课题组前期与上海交通大学材料科学与工程学院合作制备出圆柱形FPT Cage（图1），截面直径5 mm、高度1 cm。样品FPT Cage孔隙率58%～95%、孔径100～400 μm；抗压强度190.7 MPa、抗弯强度159 MPa、弹性模量4.15 GPa。样品FTP Cage的孔隙度明显高于天然珊瑚人工骨（孔径200 μm、孔隙率53%），弹性模量介乎于人体皮质骨与松质骨之间（皮质骨拉伸模量17 GPa、松质骨100 MPa）［7-8］，特别是其韧性远超粉末发泡烧结制备的多孔钛。

1.3 富血小板血浆制作及血小板计数

手术前20 min采用Landesberg等［9］的方法制备PRP，制作全过程无菌操作。用预先含有1 mL复方枸橼酸钠抗凝剂的20 mL注射器，于颈椎术前取实验犬前肢静脉血20 mL，摇匀后提取1 mL行外周静脉血血小板计数；余20 mL置入离心管中，分2次离心。第一次1 500转/分，离心10 min，吸取全部上清及交界面以下3 mL的红细胞至另一离心管，平衡后再次离心，3 000转/分，离心15 min。离心管中血小板分成2层，上层上清液为贫血小板血浆，下层为血小板浓缩物。弃上清液上3/4部分，剩余液体约2.5～3 mL，摇匀，即为富血小板血浆。全自动血细胞分析仪测定外周静脉血和PRP中的血小板数量。

1.4 PRP与FTP Cage的复合

FPT Cage融合术前5 min，将含有1 000 U/mL凝血酶的100 g/L CaCl2溶液按体积比1∶10加入PRP离心管中，混合摇匀。将FPT Cage置入直径4 mm的橡皮软管中，用5 mL注射器抽吸激活的PRP以浸泡橡皮管中的FPT Cage 1 min。

1.5 手术方法及术后处理

实验犬给予3%戊巴比妥钠静脉麻醉（1 mL/kg），术前30 min静脉滴注头孢拉定预防性抗感染。麻醉成功后，颈前路手术区域备皮并消毒铺巾，颈前右侧纵形切口，颈动脉鞘肌间隙入路显露至颈前正中区域，必要时切断颈长肌，充分显露C4/5、C5/6椎间隙，助手手法牵引适度牵开椎间隙，刮匙清除椎间盘，牵引状态下于C4/5椎间放置无PRP浸泡的FPT Cage，C5/6椎间放置PRP浸泡的FPT Cage，彻底止血并逐层关闭切口。麻醉苏醒后观察实验犬四肢肌力变化及呼吸情况，并在术后24 h内严密观察实验动物的生命体征，口服头孢拉定胶囊粉末预防伤口感染。

实验犬术后4个月在静脉麻醉下快速失血方式致死，经左心室先以100～150 mL、0.85%的生理盐水灌注，再以300 mL、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液配置的4%多聚甲醛（pH值7.4）灌流固定，灌注时间约持续30 min。颈椎标本切取范围从枕颈结合部至第一胸椎椎体，剔除周围肌肉、韧带，确认C4/5、C5/6椎间隙后，完整切取C4～C6椎体和椎间隙并进行影像学检查。

1.6 影像学检查

①颈椎标本置于标本床上，拍摄正侧位X线片。②颈椎标本安装至合适样品床，置于SkyScan 1076显微CT扫描机的中心位置，预扫后设定电压、电流、过滤器、分辨率，进行平场矫正，设定扫描步长后扫描标本。由两位有经验的脊柱外科医师采用双盲法对X线片检查和显微CT检查结果进行判定。

2 结果

2.1 PRP制备、激活和血小板计数

犬外周静脉血中血小板计数为（154±52）× 109/L，PRP中血小板计数为（728±194）×109/L，约为外周静脉血的4.71倍。PRP激活后约15 min形成肉眼可见的凝胶样物质，PRP激活后5 min内，采用5 mL注射器反复抽吸浸泡的方法，以确保FTP Cage孔隙内充满激活中的PRP。

2.2 一般情况

手术顺利，手术时间1.0～1.5 h，失血量50～80 mL，术后无神经功能障碍，均成活至处死前，无伤口感染等手术并发症。处死过程中肉眼观察FPT Cage周围无炎性组织，但有增生疤痕组织，所有椎间融合器肉眼未见明显移位。

2.3 影像学检查结果

结合X线片和显微CT检查结果，6例标本中4例出现不同程度的C4/5节段Cage沉降，2例未出现沉降，但可以观察到Cage部分向前移位；C5/6节段仅1例Cage向前移位，未发现Cage沉降。见图2～4。

3 讨论

3.1 融合器沉降对老年患者颈椎椎间融合的影响

椎间融合器沉降是融合器进入邻近椎体终板的一种影像学表现，沉降后椎间高度丢失，椎管狭窄，生理曲度改变，存在导致邻近节段退变的潜在风险。但其临床重要性尚未得到证实，有研究认为沉降与手术效果并无明显相关性［10-11］。但我们认为椎间器沉降所导致的局部生理曲度改变，不利于维持颈椎椎间生理高度和椎间孔高度，对患者远期疗效可能造成不良影响。尤其是对于老年患者，由于同时存在骨质疏松，其成骨能力较青壮年差，更易导致椎间融合器沉降的发生；其椎体与椎间融合器的弹性模量常不能匹配，这也是加剧融合器沉降的重要因素；而一旦椎间融合器发生沉降，沉降本身会反过来引起其与骨界面的力学状态改变，成骨更为困难，更容易导致脊柱不融合或延迟融合等问题的发生。

图2 Cage移位颈椎显微CT检查结果C4/5、C5/6椎间隙高度均得到维持，但C4/5、C5/6融合器均向前轻度移位图3 C4/5Cage沉降、C5/6Cage未沉降颈椎正侧位X线片3A C4/5椎间隙高度丢失，椎间融合部分进入C4椎体内3B C5/6间隙高度得到维持，融合器位置位于上下终板之间图4 C4/5Cage沉降、C5/6Cage未沉降显微CT检查结果4A C4/5椎间隙高度丢失，椎间融合部分进入C4椎体内4B C5/6间隙高度得到维持，融合器位置位于椎间隙内

至于椎间融合术式对颈椎手术融合器沉降的影响，多数术者会采取联合前路钛板固定来避免椎间融合器发生沉降，单独应用椎间融合器并不多见。Dai和Jiang［10］应用碳纤维或聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）椎间融合器联合前路钛板固定，短期内可起到减少椎间融合器沉降、增加植骨融合的效果，但长期随访结果并无明显优势。Wu等［11］对单纯应用钛椎间融合器的随访结果表明，随访期间椎间融合器沉降率和融合率均较高（分别为19.1%和100%），而沉降后患者的临床疗效并未受到影响，作者推测可能与沉降病例椎间孔高度并未明显丢失有关。Kast等［12］的随机对照研究结果显示，PEEK椎间融合器的沉降率为29%，往往需要联合前路钛板才能减少沉降，提高骨融合率；但前路钛板植入会产生应力遮挡，且存在一定的操作风险及并发症，增加患者的经济负担，因此仍倾向于单纯应用椎间融合器手术治疗颈椎病，可取得确切的临床疗效，本实验研究采取的就是单纯椎间融合器手术，但其仍存在骨长入慢、需要长期辅助颈托等外固定的缺点。

3.2 FPT材料在骨质疏松椎体椎间融合中的应用

如前所述，FPT具有良好的骨传导性和生物相容性，弹性模量更接近于人体颈椎，尤其是对于合并骨质疏松的老年人，能够满足骨与关节复杂的生物力学要求，并可根据具体要求制备成不同形状。本实验采用的FPT材料孔隙直径介于100～400 μm之间，孔隙率为58%～95%，与文献报道的促进骨长入的最佳多孔材料（孔隙直径150～600 μm、孔隙率60%以上）相一致［7-8］。也就是说，由FPT制成的椎间融合器既可保持其在生物体内的力学强度，又可减少金属材料所产生的应力遮挡，降低了因植入材料不当而导致的手术失败发生率。本实验6例标本中，未复合PRP的C4/5节段椎间融合器有4例出现不同程度的沉降，另2例虽未出现沉降，但亦可观察到Cage的向前移位，这可能与比格犬颈椎不是垂直负重的生物力学特性有关，但也可能与FPT材料融合器骨长入过程缓慢、骨性融合时间较长有关。

3.3 复合PRP在阻止FPT椎间融合器沉降中的作用

为解决FPT材料骨长入缓慢、骨性融合时间长的缺点，学者们进行了大量有益的尝试。作为一种公认的骨诱导因子，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）已广泛应用于骨科及口腔科组织修复中，但其来源有限，价格偏高，部分患者无法接受，应用因此受到限制。对FPT进行钙磷涂层改性可达到促进骨融合的目的。Vehof等［13］指出，钙磷涂层的FPT材料复合大鼠骨髓细胞有更好的骨融合表现；但随后该研究小组发现，钙磷涂层的FPT材料填充转移生长因子与未涂层组比较并未有明显促进骨融合的作用［14-15］，同样的结果也被Kamoda等［16］的研究所证实。本研究考虑到PRP与钙磷离子之间可能存在相互促进或抑制的作用，因此未采用钙磷涂层活化的FPT材料，而是通过无涂层处理的FPT颈椎椎间融合器复合PRP来达到促进骨长入的目的。

PRP是一种源自自身周围静脉血、通过离心提取制作的含高浓度血小板的血浆，其利用钙离子及凝血酶的激活、脱颗粒作用，释放出大量的生长因子，刺激骨诱导及有丝分裂，加强骨愈合［17］。Marx等［18］提出，PRP中的血小板浓度必须是全血血小板浓度的4倍以上，否则只能称之为贫血小板血浆，生长因子含量极低，无法达到促进组织再生的作用。本实验制备的PRP中血小板计数均为全血的4倍以上，具备产生大量生长因子（血小板源性生长因子、转移生长因子、血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子等）和促进骨生长的作用。国外学者Kamoda等［16］将PRP复合羟基磷灰石应用于大鼠腰椎椎间融合，影像学及组织学均证实其可获得更高的椎间骨融合率；Scholz等［19］的研究结果表明，复合PRP可促进填充自体骨的腰椎PEEK椎间融合器内的骨融合。但也有不同的观点，Cinotti等［20］认为，PRP并未促进兔腰椎后外侧自体植骨融合过程；Sys等［21］的临床研究亦表明，腰椎后路单节段椎间融合过程中复合PRP的自体植骨无明显促进骨融合的作用。本实验影像学检查结果支持前一种观点，在C5/6节段活动范围比C4/5节段更大、椎间融合时更容易发生沉降的情况下，复合PRP的C5/6节段椎间融合器未观察到沉降，仅有1例Cage向前移位；而未复合有PRP的C4/5节段椎间融合器有4例出现不同程度的沉降，另2例虽未出现沉降，但亦发生Cage的向前移位。这有力地证明复合PRP能够促进FPT颈椎椎间融合器的骨长入，对减少融合器沉降起到重要作用。其他需要考虑的因素还包括，PRP对C5/6节段FPT椎间融合器内骨长入和植骨融合过程的促进作用，使邻近节段的活动范围增加，由此导致未复合PRP的C4/5节段椎间融合器更易发生沉降。

3.4 不足之处

不同种类的动物对于生长因子及椎间融合器的反应有可能不同，这使得该实验结果不能完全适用于人类。生理状态下，无法直立行走的比格犬并不能完全模拟人类正常状况下的颈椎生物力学环境，即比格犬椎间骨融合过程中缺乏应力刺激促进骨细胞生长的因素。但是目前还无法在动物实验中找到方法来完全模拟人类正常状态下的生物力学状态，本研究采用的自身对照方法能部分规避非人类生理状态的因素。此外，本研究样本量较小，随访时间较短，需要将来通过大样本长期随访来动态观察复合PRP的FPT椎间融合器是否可以持续保持椎间高度，避免椎间融合器沉降；本实验亦未测定植入动物体内PRP中的生长因子浓度，能够起到促进骨愈合的生长因子最佳浓度还有待进一步研究。

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Effects of platelet-rich plasma on subsidence of fiber porous titanium Cage for old dogs with anterior cervical interbody fusion

CAO Shifeng*，XIE Ning，SONG Xin，ZHAO Zhenguo，NI Ming，JIAO Kun，YIN Weizhong.*Department of Orthopaedics，Pudong New Area People's Hospital，Shanghai 201200，China.

Objective To observe the effects of platelet-rich plasma（PRP）on subsidence of fiber porous titanium（FPT）Cage for old beagle dogs with anterior cervical interbody fusion.Methods Six old healthy beagle dogs（3 male and 3 female，weighing 12.5-15.0 kg，aged 7-9 years）were selected in this study.Peripheral venous blood from dog's forelimb was collected，PRP was prepared by double centrifugal methods，and blood platelet counts of peripheral venous blood and PRP were recorded.Then the dogs underwent anterior C4/5 and C5/6 discectomy and FPT Cage interbody fusion.FPT Cage was used alone at C4/5 segment，and at C5/6 segment，FPT Cage was augmented with PRP.The animals were sacrificed in 4 months after the surgery，and the subsidence of FPT Cage was evaluated byray and Micro-CT examinations.Results Subsidence of FPT Cagewas found at four C4/5 segments，other two FPT Cages at C4/5 segment showed anterior migration；No subsidence of FPT Cage was observed at six C5/6 segments，only one FPT Cage with anterior dislocation was found.Conclusion Compound PRP could reduce the subsidence of FPT Cage in old aged Beagle dogs with anterior cervical interbody fusion.

Platelet-rich plasma；Platelet activation；Osteoporosis；Cervical vertebrae；Spinal fusion；Interbody fusion cage；Titanium；Subsidence；Micro-CT；Dogs

R687.3，R681.4，R977.8

A

1674-666X（2015）04-214-07

2015-06-07；

2015-07-15）

（本文编辑：白朝晖）

10.3969/j.issn.1674-666X.2015.04.004

上海市浦东新区科技发展基金创新基金（PKJ2012-Y57）

201200上海，浦东新区人民医院骨科（曹师锋，宋鑫，倪明，焦鲲，尹伟忠），放射科（赵振国）；200003上海，长征医院骨科（谢宁）

E-mail：caoshifengguke@163.com