寄生隐丛赤壳菌ITS分子检测技术研究

麻文建, 朱天辉, 韩 珊

(四川农业大学林学院, 雅安 625014)



寄生隐丛赤壳菌ITS分子检测技术研究

麻文建, 朱天辉*, 韩 珊

(四川农业大学林学院, 雅安 625014)

寄生隐丛赤壳菌是引起板栗疫病的致病菌。为建立该菌的分子检测技术,本研究首先采用通用引物ITS1/ITS4对分离自四川雅安、泸州及重庆的寄生隐丛赤壳菌及其他参试菌株的ITS区进行PCR扩增和测序比对。根据该片段与GenBank中隐丛赤壳属其他种的ITS序列差异,设计了寄生隐丛赤壳菌的特异性引物ITSP1/ITSP2,片段扩增大小为462 bp。利用该引物对菌株基因组DNA进行扩增，可以将寄生隐丛赤壳菌与其他参试菌区分开,检测灵敏度达30 pg。而以引物ITS1/ITS4和ITSP1/ITSP2进行的巢氏PCR,可检测到30 fg基因组DNA,其灵敏度较常规PCR提高了1 000倍。利用巢氏PCR 检测体系对发病程度不同的组织和携菌组织进行检测,均能快速稳定地检测出寄生隐丛赤壳菌。

寄生隐丛赤壳菌; 分子检测; ITS; 特异引物; 巢氏PCR

板栗疫病广泛分布于世界各地,是栗树的主要病害。该病于1904年首次在美洲发现,由于其危害严重,蔓延迅速,曾使欧美一些地区栗树遭到灭种的威胁[1]。我国于1913年发现该病,随后各地陆续有报道[2]。Anagnostakis[3]认为我国板栗品种有较高的抗病性,但多数地区该病仍有不同程度的发生。近几年受气候和环境等因素的影响,板栗疫病发病呈上升趋势,已经成为板栗产业健康发展的重要限制因素[4-5]。

引起板栗疫病的病原菌属子囊菌亚门(Ascomycotina),核菌纲(Pyrenomycetes),球壳菌目(Sphaeriales),间座壳科(Diaporthaceae),学名为寄生隐丛赤壳菌[Cryphonectriaparasitica(Murrill) M.E. Barr]。主要危害中国板栗(CastaneamollissimaBlume)、欧洲板栗(C.sativaMill.)、锥栗[C.henryi(Skan) Rehd.etWils.]、美洲板栗[C.dentata(Marsh.) Borkh.]等山毛榉科植物[1]。该病原主要以伤口侵入方式为主,其症状表现为主干、分枝及小枝上出现烂皮、溃疡,严重时整个枝条甚至全株枯死。2005年之前,我国曾将板栗疫病列入森林植物检疫对象,之后虽被取消,但仍属于全国林业危险性有害生物[6]。目前对该病尚无有效的根除措施[7],只能加强检疫防止其流行和暴发。过去对板栗疫病的检疫主要依靠病原形态、病害特征判断,不仅费时、费力、准确性低,且对潜伏期和发病初期病害难以识别,例如板栗疫病发病初期病斑形状与树皮皮孔极为相似,普通方法难以区分。

近年来,PCR及各种基于PCR的技术被广泛应用于植物病原分子检测。其中基于核糖体内转录间隔区(ITS)序列特征的PCR技术的应用最为广泛。ITS区在种内具有保守性,在科、属间及属内不同种间又具有特异性,利用这一特点设计特异引物来检测病原菌,很大程度上推动了植物病害的检测和病原鉴定工作[8-9]。ITS-PCR技术具有快速、准确、灵敏度高等优点,已在剑兰和茶树炭疽菌(Colletotrichum)[10-11],雪松、烟草、大豆等各种疫霉菌(Phytophthora)[12-15],落叶松枯梢病菌[Botryosphaerialaricina(K.Sawada)][16],大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthephaseolorumvar.caulivoraAthow & Caldwell)[17]及镰孢属(Fusarium)[18]等病原菌的鉴定、分类、系统发育及检测研究方面得到广泛应用。与此同时,许多新的检测方法应用也是以ITS-PCR为基础开展的,如Real-time PCR[19-22],多重PCR技术等[23-24]。目前,国内有关寄生隐丛赤壳菌分子检测的研究还未见报道,本研究旨在根据寄生隐丛赤壳菌的ITS序列特征,设计特异性引物,建立一套快速、准确、高效的PCR检测方法,方便检疫部门检测诊断时使用,也为板栗疫病的早期诊断及防治提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 参试菌株

本研究采用的寄生隐丛赤壳菌及其他参试菌株分离自不同板栗栽培区的发病板栗枝干组织。编号代表不同地区或同一地区不同发病植株上所分离的不同菌株。样本均采自具有典型溃疡斑的枝条或枯死的板栗枝干组织。菌株编号、菌种、分离地区及引物特异性验证详见表1。

表1 参试菌株信息及引物验证结果1)

1) “+”表示有条带;“-”表示无条带。

“+” a single PCR band; “-” no PCR band.

1.2 参试菌菌丝收集及DNA提取

1.2.1 菌丝收集

所有参试菌株经PDA培养基纯化培养后,挑取新鲜菌丝块接入PDB液体培养基中,25 ℃振荡培养7 d,用灭菌纱布过滤,用灭菌蒸馏水冲洗3次,收集菌丝,冻干捣成粉末,-20 ℃保存备用。

1.2.2 参试菌基因组DNA提取

参考许立强等[25]的方法，略有改动。取约100 mg冻干菌粉置于2 mL离心管中，加入1 mL裂解缓冲液(150 mmol/L EDTA, 50 mmol/L, Tris pH 8.0,3% SDS)，充分混匀后置于65 ℃水浴1 h；12 000 r/min离心5 min；取上清液，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混匀，12 000 r/min离心3 min；取上清，加入65 μL 5 mmol/L NaCl和1 mL酚/氯仿/异戊醇混匀，12 000 r/min离心3 min，取上清液，加入65 μL 5 mol/L NaCl和300 μL的异丙醇混匀，12 000 r/min离心1 min；弃上清，加300 μL 70%乙醇洗涤沉淀，晾干至无乙醇味；加入100 μL TE(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)溶解DNA，加入1 μL RNA酶，37 ℃水浴1 h,加入500 μL氯仿/异戊醇(24∶1)，12 000 r/min离心5 min，重复2次；取上清，加1/10体积的3 mol/L 的NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，-70 ℃沉淀1 h；最后用75%乙醇漂洗沉淀，风干后加100 μL TE溶解，所提DNA在紫外分光光度计(UV-3600)下测定A260和A280，A260/A280在1.80左右表明其纯度较好，DNA溶液保存于-20 ℃，PCR反应时稀释至30 ng/μL。

1.3 利用通用引物扩增ITS序列

利用White等[26]设计的真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3-3′)/ITS4 (5′-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增所有参试菌株的基因组DNA。

PCR反应体系和程序:反应混合液总体积为25 μL,包括10×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 500 mmol/L KCl)2.5 μL、 10 μmol/L的引物ITS1/ITS4各0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、5 U/μLTaq酶0.2 μL、模板DNA 1 μL,加灭菌双蒸水补足25 μL。以灭菌水代替模板DNA作为阴性对照。反应混合液于Mastercycler Personal PCR仪(Eppendorf)上进行扩增,反应程序为:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性40 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃延伸10 min。反应结束后,取5 μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳30 min(120 V),经EB染色后,在凝胶成像系统上观察并拍照。

按照天根琼脂糖DNA回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收、纯化,送往上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 特异引物设计与合成

根据本实验室测得的寄生隐丛赤壳菌ITS序列和已报道的Cryphonectria属其他种(登录号:AF452115、AY697940、EU442647、EF026116、EU442648、EU442655)的ITS序列差异设计寄生隐丛赤壳菌的特异引物ITSP1(5′-CCAGATACCCTTTGTGAACT-3′)/ITSP2(5′-TCAGAGTCTTAGCGAGCC-3′),扩增片段大小462 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 特异引物PCR验证

利用引物ITSP1/ITSP2对所有参试菌株进行PCR扩增。PCR反应体系同1.3，以特异性引物ITSP1/ITSP2代替ITS1/ITS4。以灭菌双蒸水代替模板DNA为阴性对照。反应混合液于Mastercycler Personal PCR仪(Eppendorf)上进行扩增。扩增程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性40 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环;72 ℃延伸7 min。取10 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色后,在凝胶成像系统上观察并拍照。

1.6 灵敏度检测

将寄生隐丛赤壳菌的基因组DNA以10倍浓度梯度稀释成30 ng/μL、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL、300 ag/μL。各取1 μL作为常规PCR和巢氏PCR的反应模板,比较两者灵敏度。

1) 常规PCR:反应混合液总体积为25 μL,其中10×PCR buffer(100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.3; 500 mmol/L KCl)2.5 μL、10 μmol/L引物ITSP1/ITSP2各0.1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、5 U/μLTaq酶 0.2 μL、DNA模板1 μL,灭菌双蒸水补足至25 μL。扩增程序同1.5。

2) 巢氏PCR:以真菌通用引物ITS1/ITS4为第一轮PCR扩增引物,反应体系和程序同1.3。其PCR产物稀释10倍后作为第二轮PCR的模板,以ITSP1/ITSP2为第二轮反应的引物。第二轮反应体系和程序同常规PCR。

1.7 板栗枝干组织中寄生隐丛赤壳菌的检测

分别采集不同发病程度的板栗疫病样本:新枯死组织、具有典型症状的发病组织、初发病组织、感染未发病组织、枯死株残体及健康组织。用刀片切取100 mg左右的组织,用70%乙醇表面消毒后,蒸馏水冲洗,吸水纸吸干组织表面水滴,置于研钵中用液氮研磨成粉末, 采用天根公司植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)提取样品DNA。

分别采用1.6中常规PCR和巢氏PCR的体系和程序进行检测,以ddH2O为阴性对照。反应结束后,取5 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测。

2 结果与分析

2.1 利用通用引物扩增ITS序列

利用真菌通用引物ITS1/ITS4能从寄生隐丛赤壳菌及其他参试菌株中扩增出650 bp左右的条带,而阴性对照无条带(图1),表明所有菌株基因组DNA均成功提取,可以用于后续PCR扩增。应用软件MEGA 5.0对寄生隐丛赤壳菌及其他参试菌株的ITS序列进行比对分析,结果表明，来自重庆、四川雅安和泸州的寄生隐丛赤壳菌病原菌ITS序列并无差异,同源性达100%。向NCBI提交序列后获得登录号:KJ528274、KJ528273、KJ528272。

图1 通用引物ITS1/ITS4对供试菌株PCR扩增结果Fig.1 PCR products of tested strains using universal primers ITS1/ITS4

2.2 引物特异性验证

引物ITSP1/ITSP2能从寄生隐丛赤壳菌中扩增出1条462 bp的条带(图2),其他参试菌株及阴性对照均无任何条带,说明该引物对寄生隐丛赤壳菌具有特异性。PCR产物经回收测序比对表明,该片段与GenBank中寄生隐丛赤壳菌的ITS区序列同源性为100%,证明该PCR片段来源于寄生隐丛赤壳菌,故排除假阳性的可能。

图2 引物ITSP1/ITSP2特异性检测Fig.2 PCR amplification of Cryphonectria parasitica using specific primers ITSP1/ITSP2

2.3 引物灵敏度检测

由图3可知,常规PCR检测极限为30 pg的基因组DNA,低于30 pg则不能检测到条带,而巢氏PCR可达到30 fg,其检测灵敏度至少提高了1 000倍。田间植物病害的分子检测需要有较高的准确性和灵敏度,尤其从病状不明显或隐症病害样本中提取病原菌的DNA,其含量往往极低,常规PCR很难检测到,而巢氏PCR则可以满足检测要求。

图3 巢氏PCR和常规PCR的灵敏度检测Fig.3 Sensitivity of nested PCR and regular PCR for detection of Cryphonectria parasitica

2.4 板栗枝干组织中寄生隐丛赤壳菌的检测

分别采集自然条件下健康、感染未发病、感染初发病、典型发病组织、新枯死组织和病株残体,提取基因组DNA后,先后采用常规PCR和巢氏PCR检测寄生隐丛赤壳菌,结果(图4)表明,利用真菌通用引物ITS1/ITS4进行第一轮PCR扩增时仅新枯死组织和典型发病组织扩增出条带，且出现了杂带,可能是该引物对植物样本DNA或其他真菌DNA的ITS区也进行了PCR扩增,但不影响对寄生隐丛赤壳菌的第二轮PCR检测。利用特异引物ITSP1/ITSP2进行常规PCR和巢氏PCR可以从典型发病组织和新枯死组织中检测到寄生隐丛赤壳菌,而巢氏PCR还可以从初发病、病株残体和携菌组织中检测到病原菌,说明巢氏PCR具有较高灵敏度和特异性,更适合于田间板栗疫病的快速、准确检测。对PCR产物进行测序比对和病原分离鉴定,结果表明检测出的含有病原的样本均含有寄生隐丛赤壳菌。

图4 利用常规PCR和巢氏PCR检测板栗组织中寄生隐丛赤壳菌Fig.4 Detection of Cryphonectria parasitica from Castanea spp. by using nested PCR and regular PCR

3 结论与讨论

板栗疫病是世界范围内的一种病害,从发现至今国内外许多学者对其开展了广泛和深入的研究。目前主要集中在对寄生隐丛赤壳菌的遗传[27-28]、营养体亲和[29-30]、致病机理[31]、防治[32]的研究上,关于其分子检测方面的相关报道较少。Popov等[33]根据寄生隐丛赤壳菌的信息素前体编码基因设计引物用于PCR分子检测;Marra等[34]用DNA杂交技术设计出栗疫菌交配型特异性引物及配套巢氏引物,用于区分两种交配型。潘琪等[29]用栗疫菌交配型特异性引物以及配套巢氏引物PCR,用于野生菌菌株交配型测定。而国内,针对该病原菌开展分子检测尚未见报道。

本研究通过对GenBank中寄生隐丛赤壳属(Cryphonectria)其他种和本实验室所测得的寄生隐丛赤壳菌ITS区序列进行同源性比对,设计了一对用于检测寄生隐丛赤壳菌的特异性引物ITSP1/ITSP2。利用该对引物对参试菌株基因组DNA进行了PCR扩增,结果表明,该引物具有较高的特异性,仅从寄生隐丛赤壳菌基因组中扩增出1条462 bp的条带,其他参试菌株和阴性对照均无任何条带。常规PCR和巢氏PCR的灵敏度检测结果表明,两种方法均有较高的灵敏度,但巢氏PCR是经过两轮扩增,具有更高的检测灵敏度,可以检测到3 fg的基因组DNA,是常规PCR的1 000倍以上。对板栗不同发病程度组织的检测结果也表明巢氏PCR对病状不明显、隐症病害尤其有效,这与许多学者的报道一致[35]。因此,巢氏PCR更适合用于田间病害的早期诊断。

引物ITS1/ITS4和ITSP1/ITSP2组成的巢氏PCR,能从参试菌株和发病程度不同的植物组织中检测出寄生隐丛赤壳菌,准确率达100%,这对板栗疫病的早期诊断具有较高的实用价值。从研究材料上来讲,本研究选取了不同来源地的病原菌和部分分离自板栗植株上的其他菌株为参试菌,因而材料有一定的代表性,若将该项技术开发成分子检测试剂盒来推广应用则需要更多的样本进行验证。从研究技术来讲,本研究所采用的检测技术只做到了定性检测,还未能做到定量检测,因此,开展寄生隐丛赤壳菌定量检测将是我们今后的研究方向。

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(责任编辑：杨明丽)

Molecular detection ofCryphonectriaparasiticabased on internal transcribed spacer (ITS) sequences

Ma Wenjian, Zhu Tianhui, Han Shan

(College of Forestry, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Cryphonectriaparasitica, an important pathogenic fungus, causes chestnut blight inCastaneamollissima. The objective of this study was to set up a PCR-based technique for detection ofC.parasitica. The internal spacer(ITS) sequences ofC.parasiticaand other strains isolated from Ya’an, Luzhou and Chongqing region were obtained by PCR amplification using fungal universal primers ITS1 and ITS4. Based on different ITS sequences ofCryphonectriagenus, a pair of species-specific primers ITSP1 and ITSP2 were designed. PCR results showed that primers ITSP1/ITSP2 amplified a single product of 462 bp from DNA prepared fromC.parasitica, but not from other strains. The detection sensitivity was 30 pg of genomic DNA. Nested PCR using primers ITS1/ITS4 and ITSP1/ITSP2 could detect 30 fg of genomic DNA and the detection sensitivity was 1 000 fold higher than that of regular PCR. This nested PCR could stably and quickly detectC.parasiticafrom natural diseased and infected plant tissues.

Cryphonectriaparasitica; molecular detection; ITS; specific primer; nested PCR

2014-05-07

2014-09-07

教育部博士点基金(00329701)

S 432.44

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.023

* 通信作者 E-mail:zhuth1227@tom.com