湖南省辣椒上首次发现象耳豆根结线虫

王 剑, 宋志强, 成飞雪, 程菊娥, 张德咏*, 刘 勇*

(1. 湖南省农业科学院, 长沙 410125; 2. 湖南省农业科学院植物保护研究所,园艺作物病虫害综合治理湖南省重点实验室, 长沙 410125)



湖南省辣椒上首次发现象耳豆根结线虫

王 剑1, 宋志强2, 成飞雪2, 程菊娥2, 张德咏2*, 刘 勇2*

(1. 湖南省农业科学院, 长沙 410125; 2. 湖南省农业科学院植物保护研究所,园艺作物病虫害综合治理湖南省重点实验室, 长沙 410125)

应用线虫比较形态学、同工酶技术和IGS-PCR技术,对采自湖南省永州地区辣椒上的根结线虫进行种类鉴定。结果表明,该病原线虫为象耳豆根结线虫(Meloidogyneenterolobii),这是首次在湖南地区发现象耳豆根结线虫。

象耳豆根结线虫; 辣椒; 鉴定; 湖南省

象耳豆根结线虫(Meloidogyneenterolobii)是一种在农业生产上具有潜在危害性的植物病原线虫。其寄主范围广,且在番茄上能突破Mi基因抗性[1-2]。该线虫1983年在我国海南省儋州市象耳豆树上被发现[3]。近年来,在海南、广州等地发现该线虫寄生于豆科、茄科、葫芦科的多种重要经济作物以及番石榴等水果,且造成较大危害[1,4]，但在湖南未见其发生分布的报道。2012-2013年,我们在湖南永州地区进行蔬菜根结线虫病害调查时发现,一种根结线虫病原严重危害该地区辣椒生产,造成辣椒萎蔫,早衰,产量损失极大。我们从形态、同工酶以及分子生物学上对该病原线虫进行了种类鉴定,以期为准确鉴定与控制该病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

从湖南省永州市零陵区接履桥镇接履桥村大象组一农户辣椒地采集感病辣椒,挑取卵囊室内接种于辣椒上扩繁保存、备用。

1.2 病原线虫形态观察

观察雌虫、雄虫及2龄幼虫(J2)的形态特征,并测量特征值,共测量20 条。拔取感病辣椒,清水洗根,在倒置显微镜下用镊子和解剖针分离成熟雌虫于清水中,参照冯志新等[5-6]方法制作会阴花纹临时装片,利用Olympus显微镜(BX51型)观察雌虫会阴花纹并拍照。

挑取根中卵囊,室内孵化,分离、收集2龄幼虫,并采用热杀死、TAF固定液固定,制备临时装片,在显微镜下观察、测量体长、体宽、口针长、DGO和尾长等参数[7]。

1.3 同工酶分析

病原线虫的酯酶(Est)和苹果酸脱氢酶(MDH)分析参照Esbenshade等的方法[8],电泳分析采用DYCZ-24D型垂直板电泳槽,凝胶板大小为83 mm × 75 mm,聚丙烯酰胺胶厚度0.75 mm,分离胶与浓缩胶浓度分别为12%和5%。采用DYY-6C型电泳仪电泳,80 V 1 h，然后200 V 3 h。电泳缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。每孔道加入2个年轻雌虫的酶浸提液,以已鉴定的南方根结线虫(M.incognita)样本作为对照。Est和MDH染色过程参照Esbenshade等[9]的方法。将同一胶条先后放入Est和MDH染色液中分别显色20～30 min,直至出现清晰条带,待显色完全后漂洗3次,放入10%醋酸中固定,拍照。并参照Esbenshade等[8]的标准判断Est和MDH谱型,初步确定根结线虫种类。

1.4 分子生物学鉴定

1.4.1 ITS序列分析

利用ITS-PCR技术对采集自辣椒上的病原线虫进行分子鉴定。ITS区序列扩增通用引物[10]为F:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′,R:5′-ATCCACCGATAAGGGTAGAA-3′。采用单条线虫扩增。将消毒清洗后单条J2线虫放入含有5 μL TE buffer(pH 8.0)的0.2 mL PCR管中,加入蛋白酶K,使其终含量为0.5 mg/mL。混匀后65 ℃消化1 h,95 ℃灭活10 min,10 000 r/min 离心1 min,取上清液10 μL作为PCR反应模板。25 μL PCR反应体系中其他试剂参照《分子克隆实验指南》[11]。扩增条件为:94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环；72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。割胶回收PCR产物并送华大基因测序,测得的序列在GenBank中进行在线BLAST。

1.4.2 IGS2序列分析

根据ITS序列比对结果,参照Long[12]等的方法设计象耳豆根结线虫IGS2序列特异引物:Me-F(5′-AACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG-3′),Me-R(5′-TCAGTTCAGGCAGGATCAACC-3′),进行IGS2 PCR扩增与序列比对。扩增方法同上。利用DNAMAN将所得序列与已报道的象耳豆根结线虫序列进行同源性比对。

2 结果与分析

2.1 病原线虫形态鉴定

湖南永州辣椒上的根结线虫雌虫虫体呈梨形或椭圆形;颈明显突出,头区无环纹,唇盘圆盘状,略突起;口针细长,基部球粗大,椎体部与杆部等长;排泄孔位于近中食道球处;种群内雌虫会阴花纹有差异,呈卵圆形或椭圆形,线纹平滑,背弓低至高,无明显侧线。2 龄幼虫蠕虫形,头区略縊缩,无环纹,口针细长,椎体部与杆部分界明显,基部球大而圆,尾部透明区明显,末端钝圆(图1～2)。其J2和雌虫的形态测量值与Yang报道的象耳豆根结线虫稍有差异[3],主要表现在J2口针较长,体宽较大,尾部稍短,而雌虫体宽大于Yang描述的象耳豆根结线虫雌虫体宽。J2及雌虫主要形态测量值见表1。

图1 象耳豆根结线虫2龄幼虫及雌虫形态Fig.1 Morphology of the second-stage juveniles and female of Meloidogyne enterolobii

图2 象耳豆根结线虫雌虫会阴花纹Fig.2 Female perineal pattern of Meloidogyne enterolobii

病原线虫Nematode虫态Stage体长/μmBodylength体宽/μmBodywidth口针长/μmStyletlengthDGO/μmDorsalesophagealglandorifice尾长/μmTaillength辣椒上病原线虫Pathogenicnematodeonpepper2龄幼虫The2ndjuveniles434.5(387.7～507.8)17.3(15.0～21.1)14.4(13.4～15.3)3.8(2.9～5.4)50.9(45.8～58.2)雌虫Female630.3(486.7～821.3)623.8(283.8～687.5)15.9(12.6～16.4)5.2(3.7～6.2)—

续表1 Table 1(Continued)

病原线虫Nematode虫态Stage体长/μmBodylength体宽/μmBodywidth口针长/μmStyletlengthDGO/μmDorsalesophagealglandorifice尾长/μmTaillength象耳豆根结线虫M.enterolobii2龄幼虫The2ndjuveniles436.6(405.2～472.9)15.3(13.9～17.8)11.7(10.8～13.0)3.4(2.8～4.3)56.4(41.9～63.4)雌虫Female735.0(541.3～926.3)606.8(375.7～809.7)15.1(13.2～18.0)4.9(3.7～6.2)—

1) 表中象耳豆根结线虫的数据引自Yang,1983。

The data ofM.enterolobiiwas cited from Yang,1983.

2.2 同工酶分析

已知南方根结线虫Est和MDH酶带分别为H1和N1型[8]。对辣椒病株上分离的根结线虫群体的Est和MDH同工酶图谱(图3)分析表明，该病原线虫Est有2条主要酶带,为VS1-S1型,MDH有1条酶带,为N1a型,这与报道的象耳豆根结线虫酶带谱型一致[1]。所以根据病原线虫Est-MDH表型图谱,初步判定从湖南永州地区辣椒上分离到的根结线虫为象耳豆根结线虫。

图3 南方根结线虫和辣椒上病原线虫的Est和MDH同工酶图谱Fig.3 The esterases(Est) and malate dehydrogenase(MDH) phenotypes of Meloidogyne incognita and pathogenic nematode on pepper

2.3 分子生物学分析

利用线虫ITS序列通用引物F/R进行PCR扩增,南方根结线虫及分离获得的病原线虫都得到800 bp左右条带(图4a),将该病原线虫扩增序列割胶回收后送华大基因测序,在GenBank中BLAST,结果表明，该病原线虫的ITS序列与象耳豆根结线虫同源性达99%。

利用象耳豆根结线虫IGS2序列特异引物进行PCR扩增,分离的病原线虫扩增到236 bp目的片段(图4b),与Long等[12]报道的片段大小一致,其序列与象耳豆根结线虫同源性为100%,而南方根结线虫没有扩增到特异性目的条带。

图4 南方根结线虫与辣椒上病原线虫ITS-PCR及IGS-PCR 结果Fig.4 The results of ITS-PCR and IGS-PCR of Meloidogyne incognita and pathogenic nematode on pepper

3 结论与讨论

本研究从比较形态学、同工酶电泳以及分子生物学方面对湖南永州地区感病辣椒植株上分离的病原线虫进行了种类鉴定。结果表明,该病病原线虫为象耳豆根结线虫。据报道,在我国象耳豆根结线虫仅在海南、广州地区被发现[1,4,13],在湖南未曾报道有象耳豆根结线虫的分布。本研究表明,从湖南永州地区感病辣椒植株上分离的根结线虫为象耳豆根结线虫,这是除海南、广州外又一地区发现象耳豆根结线虫。卓侃等曾推测象耳豆根结线虫在我国南方亚热带、热带地区可能有较广的分布[1],本研究是对其推测结果的一个有力证明,这对了解象耳豆根结线虫的分布情况及其潜在危险具有非常重要的意义。

辣椒是湖南广泛栽培的蔬菜品种之一,在以往的调查中发现湖南地区根结线虫种类主要为南方根结线虫[14],其在湖南对辣椒的侵染并不严重,未见引起明显的产量损失。而从湖南永州地区感病辣椒植株上分离的根结线虫种群对辣椒侵染率极高,发病地块病株率达100%,感病辣椒萎蔫严重,出现明显早衰,产量损失极大。象耳豆根结线虫种群在湖南地区的发现,为有效采取检疫、防治措施,防止该病原线虫的传播扩散及其危害提供必要的依据。而象耳豆根结线虫是否会成为湖南地区继南方根结线虫后的又一重大根结线虫病原,还有待于进一步的研究。

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(责任编辑：杨明丽)

First report ofMeloidogyneenterolobiion pepper in Hunan Province

Wang Jian1, Song Zhiqiang2, Cheng Feixue2, Cheng Ju’e2, Zhang Deyong2, Liu Yong2

(1. Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 2. Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops in Hunan Province, Changsha 410125, China)

The root-knot nematodes on pepper collected from Yongzhou， Hunan Province were identified by using morphological characters, isozymes and IGS-PCR. The results suggested that the root-knot nematodes wereMeloidogyneenterolobii. It was the first report ofMeloidogyneenterolobiiin Hunan Province.

Meloidogyneenterolobii； pepper； identification； Hunan Province

2014-04-18

2014-07-31

公益性行业(农业)科研专项(201103018)

S 432.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.035

* 通信作者 E-mail:dyzhang@163.com, haoasliu@163.com