丙型肝炎病毒NS3-5B转基因小鼠模型的构建

赵海卫 ，韩佩君，姚敏，吕欣，雷迎峰，杨敬，乔卿华，翁代慧，党品香，尹文

第四军医大学 a.基础医学部微生物学教研室；b.西京医院输血科；陕西 西安 710032

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝病的主要病原体之一，目前全球至少有1.7亿感染者。持续HCV 感染会引起肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，至今尚无有效的预防性疫苗，干扰素联合利巴韦林的标准疗法虽有一定效果但仍有缺陷[1-2]。HCV 为单股正链RNA 病毒，属于黄病毒科肝炎病毒属，基因组全长9.6 kb，编码10 个病毒蛋白，包括结构蛋白（Core、E1、E2）和非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[3]。其中，非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B聚集在感染细胞的内质网膜上形成复合物（复制复合体），为病毒RNA 的复制提供了稳定的微环境[4-6]。NS3 具有丝氨酸蛋白酶和RNA 解螺旋酶的双重活性，前者在病毒前体蛋白成熟过程中发挥切割不同非结构蛋白的功能，后者在病毒RNA 复制中发挥解螺旋功能[7-8]。NS4A 作为NS3 蛋白酶活性的辅因子，与NS3 结合并辅助其锚定在内质网膜上[9]。NS4B 和NS5A 是病毒RNA 缠绕蛋白，是复制复合体形成的重要结构成分，并参与诱导内质网膜改变[4,10-11]。NS5B，即RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），是病毒RNA 复制过程中的关键酶，已经成为抗HCV 治疗的重要靶点之一[12]。最近，已有HCV RdRp 抑制剂（Sofosbuvir）获准上市，该药治疗效果显著，但成本高昂、临床监测复杂使其难以被推广使用[13]。缺乏表达RdRp 酶活性的体内试验模型是HCV RdRp抑制剂研发缓慢的主要原因。

实际上，NS5B 蛋白虽是HCV RNA 复制过程中最关键的酶，但并不能仅依靠其单独完成HCV 复制的整个过程，还需非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B 和NS5A的辅助。HCV RNA的复制是在其非结构蛋白与宿主内质网膜所形成的复制复合体中进行的，因此，只有在HCV 复制复合体中才能更加真实地模拟HCV感染中RdRp酶的活性[6]。

我们前期已构建了表达HCV NS3-5B蛋白的体外模型[14]，但细胞环境并不能完全真实地模拟病毒感染宿主时机体的复杂内环境，与在体实验相比还存在一定的局限性。因此，本研究以质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B为基础，构建表达HCV NS3-5B蛋白的转基因小鼠，建立HCV 复制复合体的在体模型，为HCV感染中RdRp酶活性的评价提供研究平台。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型C57BL/6 小鼠由第四军医大学实验动物中心提供；质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B[14]由本室构建；基因组DNA 提取试剂盒购自天根公司；PCR 试剂、DNA marker 和预染蛋白marker 均购自TaKaRa公司；TRIzol 总RNA 提取试剂盒、RNA 逆转录试剂盒购自Invitrogen 公司；RIPA 裂解液（强）购自碧云天公司；抗HCV NS5B 小鼠单克隆抗体由本实验室制备；抗HCV NS3/4A 小鼠单克隆抗体和抗β-actin小鼠单克隆抗体均购自Abcam 公司；红外标记兔抗鼠IgG 二抗购自LI-COR 公司；其余化学试剂均为国产分析纯产品。

1.2 引物设计与合成

以pJ6/JFH-1（GenBank：AB114136.1）基因序列和β-actin（GenBank：NM001244575）基因序列为模板，相关引物设计如表1，所有引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 目的基因线性化及受精卵显微注射

质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 经EcoRⅠ酶切，其线性化基因片段作为受精卵注射目的基因。琼脂糖凝胶电泳纯化目的基因，以野生型C57BL/6 雌性小鼠为实验对象，按照常规方法进行受精卵显微注射和胚胎移植[15]。

1.4 首建鼠的鉴定

4 周龄小鼠，剪取鼠尾1～2 cm，提取组织DNA，PCR 对HCV NS3 和NS5B 基因片段分别进行鉴定（扩增条件：94℃预变性5 min，94℃30 s、58℃30s、72℃2 min，共30 个循环），PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；初鉴完成后，对鉴定阳性的小鼠，再通过PCR 进行NS3-5B 全长基因片段复鉴，上游引物为NS3引物F1，下游引物为NS5B 引物R2，反应条件为98℃10 s、68℃7 min，共30个循环，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。初鉴与复鉴均阳性者为转基因首建鼠。

表1 引物及序列

1.5 转基因小鼠传代与筛选

将转基因首建鼠与野生型C57BL/6 小鼠交配，子代小鼠鉴定方法与首建鼠鉴定方法相同，筛选出F1代转基因小鼠；将F1代转基因小鼠继续与野生型C57BL/6小鼠交配，鉴定并筛选出F2代转基因小鼠，同样方法传代并筛选至F5 代转基因小鼠；将F5 代雌雄转基因小鼠进行交配，鉴定并筛选出遗传性状稳定的纯合子转基因小鼠，将纯合子转基因小鼠继续繁育。

1.6 RT-PCR检测

用TRIzol 总RNA 提取试剂盒提取转基因小鼠肝组织总RNA，测定RNA 的浓度，按RNA 逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA；以cDNA为模板，分别扩增NS3、NS5B（扩增条件同前）和内参βactin 基因片段（扩增条件：94℃预变性5 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，共30 个循环），扩增产物经电泳鉴定。

1.7 Western印迹

用RIPA 裂解液提取C57BL/6 小鼠和转基因小鼠的肝组织总蛋白，BCA 法进行蛋白定量。取50 μg总蛋白样品，变性后经SDS-PAGE，电泳完成后将胶中蛋白条带转移至经甲醇浸泡过的PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭PVDF 膜2 h；加入用TBST 稀释的抗HCV NS3/4A 小鼠单克隆抗体（1∶1000）、抗HCV NS5B小鼠单克隆抗体（1∶500）和抗β-actin 小鼠单克隆抗体（1∶1000），4℃摇床过夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入TBST 稀释的红外标记二抗，避光室温孵育2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min，Odyssey红外成像仪成像。

1.8 血清转氨酶检测

分别对6 周龄的10 只野生型C57BL/6 雄性小鼠和10 只纯合子转基因雄性小鼠摘眼球采血，分离血清检测谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）。

1.9 病理学检查

取6 周龄纯合子转基因小鼠的肝组织，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后做HE染色，分析组织病理形态。野生型C57BL/6小鼠为正常对照。

1.10 统计学分析

用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，P＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B的构建及线性化

质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 示意图见图1，NS3-5B 基因片段在EcoRⅠ和BglⅡ位点与载体pIRES2-EGFP 连接。质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B经EcoRⅠ酶切，其线性化目的基因片段大小为11 315 bp，电泳结果可见预期大小的目的基因（图2）。

2.2 转基因小鼠基因型鉴定

转基因小鼠经PCR 扩增电泳鉴定，NS3 基因片段为1893 bp（图3），NS5B 基因片段为1772 bp（图4）；NS3 和NS5B 鉴定均阳性的小鼠的NS3-5B 全长基因为6009 bp（图5）。NS3-5B 全长基因鉴定结果与NS3和NS5B基因鉴定结果一致，且目的基因片段大小与其实际大小相符。

图1 质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B示意图

图2 质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B酶切线性化

图3 转基因小鼠NS3基因PCR扩增鉴定

2.3 RT-PCR 和Western 印迹检测转基因小鼠目的基因的表达

RT-PCR检测转基因小鼠肝组织中NS3和NS5B基因mRNA 的表达（图6A），在肝组织中检测到目的基因，大小与预期一致；Western 印迹检测转基因小鼠肝组织NS3/4A 和NS5B 蛋白的表达（图6B），在肝组织中检测到目的蛋白，大小与预期一致。

图4 转基因小鼠NS5B基因PCR扩增鉴定

图5 转基因小鼠NS3-5B基因PCR扩增鉴定

图6 转基因小鼠目的基因的表达

2.4 肝功能评价

实验数据经Levene 方差齐性检验和近似t检验分析，结果表明转基因小鼠ALT 值和AST 值与野生型C57BL/6 小鼠相比无显著性差别（P＞0.05，表2），尚不能认为HCV NS3-5B 蛋白对小鼠肝脏有损伤。ALT和AST检测结果如图7所示。

2.5 组织形态分析

HE 染色结果表明6 周龄转基因小鼠肝组织与野生型小鼠肝组织相比无形态学差异（图8）。

3 讨论

自HCV 被发现以来，研究者一直致力于抗HCV药物研发，但目前HCV 感染的预防与治疗仍然是医学领域的一大难题。传统的治疗方法是聚乙二醇干扰素加利巴韦林联合治疗，但其对某些亚型HCV 的治疗效果不佳，且易产生副作用[16]。NS5B 是由病毒自身编码的、在HCV RNA 复制过程中起关键作用的RNA聚合酶，目前被认为是抗HCV治疗的理想靶点之一[12]。实践也证实RdRp 抑制剂（Sofosbuvir）治疗HCV感染效果显著[13]，但由于缺乏有效模拟RdRp酶活性的模型，极大地阻碍了RdRp 抑制剂的研发。HCV 感染机体时，病毒RNA 的复制是在其非结构蛋白与宿主内质网膜形成的复制复合体中完成的，因此，只有在复制复合体中才能更加真实地模拟HCV复制过程中RdRp 酶的活性。我们通过显微注射法将质粒pIRES2-EGFP-NS3-5B 导入小鼠受精卵中，构建了HCV NS3-5B转基因小鼠，经一系列鉴定，证实该转基因小鼠目的基因成功表达，建立了HCV 复制复合体在体模型。

表2 ALT和AST相关参数（）

表2 ALT和AST相关参数（）

TG组为转基因小鼠；WT组为野生型C57BL/6小鼠

图7 野生小鼠与转基因小鼠血清转氨酶ALT和AST测定值

图8 野生小鼠与转基因小鼠肝组织HE染色（×200）

目前，已证实非结构蛋白NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B 共同参与完成HCV RNA 的复制，但其是否直接参与损伤肝组织尚无定论。本研究对6周龄转基因小鼠血清ALT 和AST 进行了检测，统计学分析结果与正常小鼠相比无显著性差异，尚不能认为6 周龄转基因小鼠HCV 非结构蛋白会损伤肝脏；但从其散点图（图7）离散趋势可知部分转基因小鼠ALT 值和AST 值较高，初步考虑可能与个体之间目的基因拷贝数不同有关。之前有研究发现6 月龄以上的HCV NS5A转基因小鼠肝组织才会出现一定程度的病理改变，说明非结构蛋白对肝组织的损伤程度与其持续作用时间有关[17]。本研究中HE 染色未发现6 周龄NS3-5B 转基因小鼠肝组织有任何形态改变，可能非结构蛋白对肝组织的作用时间较短，尚未造成病理变化。

综上，我们构建了表达HCV NS3-5B 蛋白的转基因小鼠模型，为HCV 感染中RdRp 酶活性的评价及其抑制剂的筛选提供了研究平台。我们后续将通过对转基因小鼠目的基因拷贝数、非结构蛋白表达量和生长周期等因素的研究，探讨HCV 非结构蛋白与肝组织损伤的关系，并进一步构建用于RdRp酶抑制剂筛选的动物模型。

[1]Wedemeyer H,Dore G J,Ward J W.Estimates on HCV disease burden worldwide-filling the gaps[J].J Viral Hepat,2015,22(Suppl 1):1-5.

[2]Hoshida Y,Fuchs B C,Bardeesy N,et al.Pathogenesis and prevention of hepatitis C virus-induced hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol,2014,61(Suppl 1):S79-S90.

[3]Brass V,Moradpour D,Blum H E.Molecular virology of hepatitis C virus(HCV):2006 update[J].Int J Med Sci,2006,3(2):29-34.

[4]Herod M.R,Schregel V,Hinds,C,et al.Genetic complementation of hepatitis C virus nonstructural protein functions associated with replication exhibits requirements that differ from those for virion assembly[J].J Virol,2014,88(5):2748-2762.

[5]Lohmann V,Korner F,Koch J,et al.Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line[J].Science,1999,285(5424):110-113.

[6]Romero-Brey I,Merz A,Chiramel A,et al.Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication[J].PLoS Pathog,2012,8(12):e1003056.

[7]Ezat A A,El-Bialy N S,Mostafa H I,et al.Molecular docking investigation of the binding interactions of macrocyclic inhibitors with HCV NS3 protease and its mutants(R155K,D168A and A156V)[J].Protein J,2014,33(1):32-47.

[8]Cheng W.Mechanisms of HCV NS3 helicase monitored by optical tweezers[J].Methods Mol Biol,2015,1259:229-255.

[9]Tanji Y,Hijikata M,Satoh S,et al.Hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing[J].J Virol,1995,69(3):1575-1581.

[10]Han Q,Manna D,Belton K,et al.Modulation of hepatitis Cvirus genome encapsidation by nonstructural protein 4B[J].J Virol,2013,87(13):7409-7422.

[11]Ross-Thriepland D,Amako Y,Harris M.The C terminus of NS5A domain II is a key determinant of hepatitis C virus genome replication,but is not required for virion assembly and release[J].J Gen Virol,2013,94(Pt 5):1009-1018.

[12]Gouklani H,Bull R A,Beyer C,et al.Hepatitis C virus nonstructural protein 5B is involved in virus morphogenesis[J].J Virol,2012,86(9):5080-5088.

[13]Keating G M,Vaidya A.Sofosbuvir:first global approval[J].Drugs,2014,74(2):273-282.

[14]韩佩君,雷迎峰,吕欣,等.丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3-5B 蛋白的真核表达载体构建及其在BHK-21 细胞中的表达[J].科学技术与工程,2013,13(36):10794-10797.

[15]程萱,陈红星,杨晓,等.提高制备转基因小鼠效率的研究[J].中国实验动物学报,2001,9(3):34-37.

[16]Poordad F,Dieterich D.Treating hepatitis C:current standard of care and emerging direct-acting antiviral agents[J].J Viral Hepat,2012,19(7):449-464.

[17]Wang A,Lee D,Moon H,et al.Non-structural 5A protein of hepatitis C virus induces a range of liver pathology in transgenic mice[J].J Pathol,2009,219(2):253-262.