脐血间充质干细胞对小鼠辐射性肝损伤的作用

颜贺欣，苏威，杨丹，高鹏，夏玉军，单守勤

1.青岛大学，山东 青岛 266071；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071；3.济南军区 第一疗养院，山东青岛 266071

伴随科技的发展，核技术的广泛应用和放射医学的发展，电离辐射对人类产生了不可避免的损伤。肝脏是辐射的敏感器官，其放射敏感性仅次于骨髓、淋巴、胃肠组织、性腺、胚胎和肾。辐射会造成肝脏形态、代谢功能、作用机制的改变，以及肝内细胞的病理、生理、生物膜、酶活性和肝微循环等的改变[1]。脐血间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）是多能干细胞的一种，它具有分化度低、有丝分裂程度低、DNA分离不对称[2]等特征，以及细胞更新、组织再生、免疫调节和多向分化的潜能[3]。应用具有强大功能的UCMSC，在辐射性肝损伤的治疗中取得很大的研究成果，是辐射医学和再生医学中治疗的理想种子。在本研究中，我们通过对小鼠全身进行X 线辐射，制作辐射损伤的模型，经尾静脉注射UCMSC 悬浮液后，检测小鼠肝细胞病理形态学变化及肝细胞内超氧化物歧化酶的活性、丙二醛含量的改变，研究人UCMSC 对辐射性肝损伤的防护作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康清洁级SD小鼠80只，体重（22±2）g，来自军事医学科学院实验动物中心；脐血间充质干细胞（DiL 标记）来自清华大学深圳研究生院。测定超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物分组

将小鼠随机分为4组，每组20只。除正常组外，采用医用直线加速器产生的X线对其余各组小鼠进行全身照射，波源距皮肤100 cm，照射剂量2 Gy。照射完毕，随机分组标记，按如下分组，分别于小鼠尾静脉注射1 mL 处于对数生长期的第3 代人UCMSC悬液或等体积的生理盐水：

①正常组：不照射，12 和24 h 仅尾静脉注射生理盐水；②放射组：照射后12 和24 h 仅尾静脉注射生理盐水；③普通组：照射后12 和24 h 分别尾静脉注射UCMSC 悬浮液和生理盐水；④加强组：照射后12和24 h后分别尾静脉注射UCMSC悬浮液。

1.3 肝组织匀浆的制备

无菌条件下取出肝组织，准确称取重量，按照重量（g）∶体积（mL）的比例加入9 倍体积生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，2500～3000 r/min 离心10分钟，上清即为10%匀浆。

1.4 检测指标及方法

观察小鼠受辐射前后的活动量、精神状态、食欲状况，并记录。

经干预后处死小鼠，取小鼠肝脏，用4%甲醛固定做石蜡切片，经石蜡包埋、切片、常规HE染色，观察肝脏的病理形态变化。

取小鼠肝组织匀浆与检测试剂按比例混合，漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，测定D532nm值，计算样品中MDA的含量。

取稀释的小鼠肝组织匀浆与检测试剂混合于96 孔酶标板混匀，37℃孵育20 min，于酶标仪上测定D550m值，计算样品中SOD的活力。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 辐射前后小鼠一般状态的变化

与正常组小鼠比较，辐射后放射组的小鼠活动量明显减少，精神较差，食欲减退。经注射UCMSC悬浮液治疗的小鼠与放射组小鼠比较，活动量有所增加，精神较好，食欲增强。

2.2 辐射前后小鼠肝脏组织的病理学形态改变

正常肝组织肝索排列有序，肝窦无充血和扩大，肝细胞无水肿变性和坏死，中央静脉管壁完整，管腔无扩大、变窄阻塞，周围无胶原纤维沉积（图1A）。与正常组比较，放射组肝细胞有不同程度的水肿、变性，中央静脉周围明显有炎性细胞浸润，周围网状纤维增多，变窄、堵塞（图1B）。与放射组比较，注射UCMSC 悬浮液治疗的普通组小鼠肝小静脉周围网状纤维减少，汇管区炎性细胞浸润有所减轻，周围网状纤维减少；加强组中央静脉管壁周围胶原纤维沉积大幅减少（图1C、D）。

2.3 辐射后小鼠肝脏SOD活力和MDA含量

图1 各组小鼠肝组织的病理学形态

2.3.1 小鼠肝细胞中SOD的活性 辐射组与正常对照组比较，SOD 活性显著降低，差异有统计学意义（F=41.89～182.96，t=10.79～22.03，*P＜0.01）。普通组与辐射组比较，SOD活性有所升高，有明显的改善作用（F=41.89～182.96，t=4.78～13.12，**P＜0.01）。加强组与普通组比较，SOD 活性有所升高（F=41.89～182.96，t=1.68～10.15，***P＜0.05）。见表1、图2。

2.3.2 小鼠肝细胞中MDA 的含量 辐射组与正常对照组比较，MDA 含量显著升高（F=158.441～632.751，t=12.13～44.22，*P＜0.01）。普通组与辐射组比较，MDA 含量有所降低（F=158.441～632.751，t=5.44～15.00，**P＜0.01）。加强组与普通组比较，MDA含量降低（F=41.89～182.96，t=10.83～26.02，***P＜0.05）。见表2、图3。

3 讨论

电离辐射可使细胞内产生自由基，如超阴离子、羟自由基、过氧化氢等[4]。这些产生的活性自由基可直接或间接破坏机体细胞的生物膜和核酸[5]，可致DNA 链断裂，使组织器官形态、代谢功能、作用机制及组织细胞内酶活性和微循环等发生改变，若不及时清除自由基，会使组织发生更为严重的物理或化学损伤[6-7]。

图2 小鼠肝细胞内SOD活性的改变

放射性肝损伤常见于全身放射性损伤（核泄漏、核爆炸等核事故的发生），以及腹部、盆腔肿瘤局部放射治疗时产生的辐射损伤。放射性肝损伤导致细胞变性、凋亡、坏死，肝酶系紊乱，生物膜破坏，代谢障碍，严重时引起肝功能衰竭。在正常情况下，人体内的自由基处于不断产生与清除的动态平衡之中，而自由基的清除主要依靠抗氧化酶的作用。SOD是一种普遍存在于有机生物体内的金属酶，它具有超强的氧化作用，可催化自由基发生歧化反应，清除自由基，从而保护受损细胞，维持机体的氧化和抗氧化反应的动态平衡。MDA是过氧化脂质的降解产物，对机体细胞有攻击力，检测MDA的含量可以反映脂质过氧化的程度，从而间接反应细胞的损伤情况。MDA与SOD测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了清除氧自由基的能力，而MDA含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的损伤程度。

图3 小鼠肝细胞内MDA含量的改变

表1 辐射损伤期各阶段受照小鼠肝细胞内的SOD活性（U/mg，，n=5）

表1 辐射损伤期各阶段受照小鼠肝细胞内的SOD活性（U/mg，，n=5）

第1 d和第2 d方差不齐，采用Dunnett T3检验；第7 d和第14 d方差齐，采用LSD检验；辐射组与正常组比较*P＜0.01，普通组与辐射组比较**P＜0.01，加强组与普通组比较***P＜0.05

表2 辐射损伤期各阶段受照小鼠肝细胞内的MDA含量（nmol/mg，，n=5）

表2 辐射损伤期各阶段受照小鼠肝细胞内的MDA含量（nmol/mg，，n=5）

方差不齐，采用Dunnett T3检验；辐射组与正常组比较*P＜0.01,普通组与辐射组比较**P＜0.01，加强组与普通组比较***P＜0.05

间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有自我复制和多向分化的潜能，并且可以自我更新，在特定条件下分化增殖为多种组织和器官的细胞。目前，我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肺、肝、胰腺等组织，以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。成人骨髓供体难求，很难获取，数量极少，且可对供体造成不可避免的创伤，易感染；胎儿的骨髓干细胞传代增殖能力虽强，但因胚胎来源问题备受争议[8]而受到限制；而脐血干细胞易于获取，来源广泛，生物特性稳定，增殖分化能力旺盛，对供体无任何伤害，是理想的种子细胞。因此，本实验选取UCMSC进行。

本试验通过制作石蜡切片，在光学显微镜下观察肝脏的病理形态，发现辐射后放射组肝细胞不同程度水肿、变性，中央静脉周围明显有炎性细胞浸润，周围网状纤维增多，变窄、堵塞，提示接受全身辐射的小鼠肝脏存在辐射损伤，说明模型制作成功。经注射UCMSC悬浮液治疗的小鼠肝细胞水肿减轻，小静脉周围网状纤维减少，汇管区炎性细胞浸润有所减轻，中央静脉管壁周围胶原纤维沉积大幅减少。经组织学标准评分表明有显著性差异。这证实UCMSC 对肝脏组织具有积极的防护抗损伤作用。研究表明，UCMSC 移植进入受试动物肝脏后，有分化为肝细胞的趋势[9]，并能间接刺激正常肝细胞再生，促进损伤肝细胞的修复，改善肝细胞功能[10]。肝细胞内酶的变化显示，放射组与正常组比较MDA值显著增高，SOD 值显著下降，证明了自由基的产生。而经注射UCMSC 悬浮液治疗后MDA 值显著下降，SOD值显著增高（P＜0.01），证明UCMSC能清除自由基，减轻自由基所致的肝细胞损伤。

UCMSC 对辐射性肝损伤的修复再生作用的机制非常复杂：一是某些特殊细胞因子如SDF-1、TGF-β、MIP-1α、MCP-I 等引导UCMSC 到肝脏损伤的局部组织[11]，在组织局部适宜环境条件下诱导分化为肝细胞；二是到达组织局部的UCMSC在刺激因子[12]的作用下分化为肝细胞；三是UCMSC可以分泌细胞因子（IL-6）[13]刺激局部肝损伤组织细胞的修复。总而言之，UCMSC 移植具有清除自由基、减轻肝损伤和促进损伤肝细胞修复再生的作用，能够有效改善肝脏功能，但注射剂量、时间及次数可能会影响治疗效果。由于间接或直接因素的作用刺激局部损伤组织细胞的修复再生，应用后的疗效评价会直接影响临床应用前景。为使UCMSC 成为临床理想的治疗手段，其具体机制机理还有待进一步探究。

[1]傅尚志.电离辐射对肝脏的损伤[J].国外医学:放射医学核医学分册,1997,21(4):188-191.

[2]Bianco P,Cao X,Frenette P S,et al.The meaning,the sense and the significance:translating the science of mesenchymal stem cells into medicine[J].Nature Medi,2013,19(1):35-42.

[3]Nakagami H,Morishita R,Maeda K,et al.Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy[J].J Atherosclerosis Thrombosis,2006,13(2):77-81.

[4]Takeshita K,Fujii K,Anzai K,et al.In vivo monitoring of hydroxyl radical generation caused by X-ray irradiation of rats using the spin trapping/EPR technique[J].Free Radic Biol Med,2004,36(9):1134-1143.

[5]谷铣之,殷蔚伯,刘泰福,等.肿瘤放射治疗学[M].北京:北京医科大学·中国协和医科大学联合出版社,1991,11(65):224-231.

[6]Barbisan L F,Scolastici C,Miyamoto M,et al.Effects of crude extracts of Agaricus blazei on DNA damage and on rat liver carcinogenesis induced by diethylnitrosamine[J].Genet Mol Res,2003,2(3):295-308.

[7]Wells P G,Bhuller Y,Chen C S,et al.Molecular and biochemical mechanisms in teratogenesis involving reactive oxygen species[J].Toxicol Appl Pharmacol,2005,207(2):354-366.

[8]Liu W,Song F,Ren L,et al.The multiple functional roles of mesenchymal stem cells in participating in treating liver diseases[J].J Cell Mol Med,2015,19(3):511-520.

[9]师玲玲,刘赴平,王立生.人脐血间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝损伤[J].暨南大学学报(自然科学与医学版),2011,32(2):188.

[10]黎娇,朱争艳,杜智,等.人脐带间充质干细胞分泌物对肝细胞增殖和凋亡的影响[J].中华肝胆外科杂志,2010,16(6):460-464.

[11]Kim C H,Broxmeyer H E.In vitro behavior of hematopoietic progenitor cells under the influence of chemoattractants:stromal cell-derived factor-1,steel factor,and the bone marrow environment[J].Blood,1998,91(1):100-110.

[12]宫黎明,方宁,陈代雄,等.人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中分化为肝细胞[J].中国组织工程研究,2011,15(36):6709-6713.

[13]Yang Lihua,Wang Yun,Wang Xiaohua,et al.Effect of allogeneic umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation in a rat model of hepatic cirrhosis[J].J Tradit Chin Med,2015,35(1):63-68.