一种解聚金属-Aβ聚集体的硫磺素T类荧光螯合剂

张勇 张哲 董雄伟 尹文星 章丹 刘长林＊,

(1华中师范大学化学学院，武汉430079)

(2湖北理工学院化学与化工学院，黄石435003)

一种解聚金属-Aβ聚集体的硫磺素T类荧光螯合剂

张勇1,2张哲1董雄伟1尹文星1章丹1刘长林＊,1

(1华中师范大学化学学院，武汉430079)

(2湖北理工学院化学与化工学院，黄石435003)

以硫磺素T为母体，合成和表征了一种解聚金属-Aβ聚集体的荧光螯合剂5-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚(FC-9)，研究了它与金属-Aβ聚集体的相互作用以及由此导致的Aβ聚集体的构象、形貌和毒性变化。结果表明，FC-9不仅能识别各种Aβ40/Aβ42聚集体，而且还能使金属-Aβ40/42聚集体解聚。FC-9与金属-Aβ聚集体相互作用后，聚集体的形貌由纤维状转化为无定形状，其β-折叠构象也减少了。FC-9还能够跨过细胞膜，符合严格的Lipinski类药标准，在一定程度上可抑制由Cu-Aβ40聚集体产生的毒性，这使得FC-9在螯合治疗老年痴呆症方面可能具有潜在的应用前景。

Aβ聚集体；硫磺素T；荧光螯合剂；解聚

老年痴呆症(Alzheimer′s disease，AD)是发生在老年人身上的一种神经退行性疾病，目前还未找出AD的确切病因和研究出有特效治疗或逆转疾病进展的药物和预防方法，因此它被列入了21世纪的疑难杂症。β-淀粉样蛋白(amyloid β protein，Aβ)是AD发病机制的分子标志物之一，它容易聚集形成不溶的高分子量的淀粉样纤维。Aβ聚集被公认为是AD的主要病理学特征之一，而且其聚集与Cu2+、Zn2+等金属离子相关[1-3]。这些金属离子与Aβ的结合能调节Aβ聚集的行为、毒性和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生[4-5]。在实验中已观察到金属离子包括Cu2+和Zn2+诱导的Aβ聚集是可逆的，Aβ聚集体的产生和解聚能被金属螯合剂所调控；对Aβ聚集体中的金属离子有较高亲和力的螯合剂，可夺取Aβ聚集体中的金属离子而形成配合物，并使其解聚，可期达到减缓或者治疗AD的目的[6-7]。因此，应用螯合剂使AD病人大脑内的金属离子达到稳态平衡而不扰乱体内其它有益性质的螯合治疗方法是治疗AD的合理选择之一[8-9]。

目前，报道了很多诸如喹啉和大环多胺等能螯合金属-Aβ聚集体中金属离子的螯合剂[10-17]。除了一种类似氯碘羟喹(clioquinol，CQ)的8-羟基喹啉类螯合剂PBT2正处于AD的二期临床研究之外，至今还没有用于治疗AD的螯合药物上市，这主要是因为这类螯合剂有很多的限制性因素，如适中的螯合Cu2+和Zn2+的能力，对人体无毒副作用等等[18-20]。因此，此类螯合剂需要进行合理化的设计，对于应用于治疗AD的多功能螯合剂的开发与研究也成了许多科学家感兴趣的课题。硫磺素T(Thioflavin T，ThT)是临床尸检用的荧光染料，它能够嵌合到Aβ的β片层折叠之中，是一种识别Aβ聚集体的荧光探针[21]。通过设计集螯合金属离子和与Aβ聚集体特异结合于一体的这样一类螯合剂，可以作为识别Aβ聚集体的荧光探针，能实时通过荧光变化等方法来监测Aβ聚集体及其解聚的过程。基于此，本文以硫磺素T为母体，将其与氯碘羟喹类似的螯合基团组合在一起，设计合成了一种荧光螯合剂5-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚(FC-9)，并用紫外吸收光谱、荧光光谱和圆二色光谱等研究了它对金属-Aβ40/42聚集体的解聚程度、构象、形貌和毒性等(图1)。

图1 以ThT为母体的荧光螯合剂FC-9的设计Fig.1 Design of fluorescent chelator FC-9 based on thioflavin T

1实验部分

1.1 仪器与试剂

实验所用化学试剂均为市售分析纯。Aβ40/42购自吉尔生化(上海)有限公司，胎牛血清和DMEM (Dulbecco′s modified eagle medium)培养基均购自美国Gibco公司。所用仪器为Perkin-Elmer 2400元素分析仪，PHS-3C型pH计，XT4A型显微熔点测定仪(未校正)，Analytik jena Specord 210紫外光谱仪，Varian Mercury 400 MHz核磁共振仪，Applied Biosystems API 2000 LC/MS/MS电喷雾质谱仪，Bruker Smart-2000 CCD单晶衍射仪，VARIANCARY荧光光谱仪，Leica DMI 3000B倒置荧光显微镜，SpectraMax Plus384型酶标仪，ChirascanTM圆二色光谱仪，TECNAI G220透射电镜。

1.2 5-氨基-2-(苯并[d]噻唑-2-基)苯酚(FC-9)的合成

以多聚磷酸为溶剂，将邻氨基苯硫酚(1.25 g，10 mmol)和对氨基水杨酸(1.53 g，10 mmol)一起加入到100 mL圆底烧瓶中，在氩气的保护下于220℃反应4 h。当反应液冷却至室温后，再将其倒入10% K2CO3水溶液中，过滤，将残渣溶于二氯甲烷中，然后加入无水硫酸镁干燥，再过滤，滤液旋转蒸发，可得浅黄色的固体。将粗产品用二氯甲烷重结晶可得浅黄色晶状粉末。产率85%。熔点：213～215℃。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：5.95(s，2H)，6.16(d，J= 7.6 Hz，1H)，6.24(d，J=8.6 Hz，1H)，7.34～7.46(m，2H)，7.62～7.88(m，2H)，8.02(d，J=8.0 Hz，1H)，11.73(s，1H)。ESI-MS：m/z 242(M+)。元素分析：实验值(计算值，%)：C 64.02(64.44)，H 4.15(4.16)，N 11.98(11.56)。

1.3 晶体的测定

选取大小为0.3 mm×0.2 mm×0.10 mm的浅黄色方形晶体FC-9置于单晶衍射仪上，采用石墨单色化的Mo Kα射线(λ＝0.071 073 nm)，于298(2)K，以ω/2θ方式扫描，在2.55°〈θ〈28.25°范围内共收集到衍射点7 662个，其中独立衍射点2 791(Rint= 0.068 8)，I〉2σ(I)的可观测的衍射点2 642个，-7≤h≤7，-11≤k≤10，-30≤l≤22。全部衍射数据经Lp因子和经验吸收校正。晶体结构由直接法解出，非氢原子坐标是在以后的数轮差值Fourier合成中陆续确定的。对全部氢原子的坐标及各向异性参数用SHELXS-97程序，以最小二乘法对结构进行精修[22-23]。表1给出标题配合物的晶体学数据，键长和键角数据见表2，氢键数据见表3。

CCDC：960540。

1.4 FC-9与金属-Aβ40/42聚集体的相互作用

在20 μmol·L-1Tris-HCl/150 μmol·L-1NaCl缓冲体系中(Tris=tris(hydroxymethyl)aminomethane，pH 7.4)，加入浓度为100 μmol·L-1的新鲜Aβ40/42，再加入(或不加入)浓度为100 μmol·L-1Cu2+(或Zn2+)溶液，置于37℃恒温水浴锅中共培养2 d，并间歇搅拌，使其形成Aβ40/42聚集体、Cu2+-Aβ40/42和Zn2+-Aβ40/42聚集体。然后在不同的金属-Aβ40/42聚集体的样品中加入FC-9于37℃恒温水浴槽中分别共培养2 d，使得最终测试的Aβ40/42样品的浓度为5 μmol·L-1(cAβ40/42∶cCu2+/Zn2+∶cFC-9=1∶1∶2)，所有的测试都平行测定3次，数据处理以平均值和标准偏差形式表示。

表1 FC-9的晶体学数据和精修参数Table1 Crystal data and structure refinements of FC-9

表2 FC-9的部分键长和键角Table2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of FC-9

表3 FC-9的氢键键长和键角Table3 Bond lengths(nm)and bond angles(°)for the hydrogen bond of FC-9

1.5 BCA(bicinchoninic acid)蛋白分析法

参照文献的方法进行BCA蛋白分析[11-13]。加入FC-9到金属-Aβ40/42聚集体中于37℃共培养2 d后，每个样品再加入20 μmol·L-1Tris-HCl/150 μmol·L-1NaCl缓冲溶液(pH 7.4)15 μL，用离心机以14 000 r·min-1的速度离心20 min后，取样品的上清液25 μL，再加入BCA溶液200 μL，混合混匀后，放在37℃水浴锅再温育30 min。当溶液的颜色由浅绿色变为紫色，再在紫外-可见光谱仪上测562 nm处的吸光度，新鲜制备的Aβ40/42样品作为对照，通过BSA标准工作曲线，来计算可溶的Aβ40/ 42含量。每个样品平行测定3次，数据处理以平均值和标准偏差形式表示。

1.6 圆二色实验

在10 μmol·L-1PBS的缓冲体系中(pH=7.4)，向50 μmol·L-1Aβ42溶液中加入(或不加入)50 μmol· L-1CuSO4(或Zn(OAc)2)，于37℃下共培养2 d，然后向其中加入FC-9(100 μmol·L-1)，于37℃共培养2 d并间歇搅拌，测试时以相同浓度新鲜的Aβ42作对照。使用圆二色光谱仪测试每个样品在190～260 nm范围内的光谱，样品池的宽度为1 mm，测试温度为25℃，每次测试的样品的基线校正都减去了缓冲液或金属离子的吸收，并且取5次校正后的平均值。

1.7 浊度测试

各种聚集体制备同BCA蛋白分析法，并用20 μmol·L-1Tris-HCl/150 μmol·L-1NaCl缓冲溶液(pH 7.4)稀释，最终测试时Aβ40/42样品的浓度为10每个样品用紫外-可见光谱仪测其在405 nm处的吸收。测试时配制相同浓度的新鲜Aβ40/42做对照，每个样品平行测定3次，数据处理以平均值和标准偏差形式表示。

1.8 透射电镜实验

1.9 细胞跨膜实验

HeLa细胞在DMEM培养基中培养，并加入10%胚胎牛血清，于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。每天细胞换液，每隔两天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬浊液浓度，以合适的密度接种细胞分别至24孔培养板进行培养(边缘孔用无菌PBS填充)，当细胞培养到有大约80%融合时，再换入无血清培养基(每孔400 μL)培养24 h，然后进行分组培养。在进行细胞成像的前一天，事先将HeLa细胞植入24孔板，第二天将FC-9加入到细胞体系中(细胞单层铺满孔底50%)，使得最终测试浓度为10 μmol·L-1，并在37℃、5%CO2的培养箱中进行培养3 h。测试时，吸去孔内的培养液，HeLa细胞用磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后将其放在倒置荧光显微镜下，用绿光激发来观察细胞的荧光成像，放大倍数为400倍。相对于细胞内FC-9的荧光强度，对细胞的明亮视野也进行了成像。

1.10 细胞毒性实验

向新鲜的Aβ40中加入(或不加入)Cu2+，并于37℃培养2 d，然后加入FC-9反应2 d(Aβ40的浓度为100 μmol·L-1，cAβ40∶cCu2+∶cFC-9=1∶1∶2)。细胞的毒性实验采用MTT法进行测定。将HeLa细胞种植于96孔板中，保证细胞密度约为1×105cells·mL-1。细胞培养24 h后，使得加入到HeLa细胞中各种Aβ40样品的浓度为5 μmol·L-1，单独的Aβ40、Cu2+和FC-9也分别作为对照组。然后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min。最后通过酶标仪在OD 490 nm处测量各孔的吸光值，评价探针的细胞毒性。

图2 荧光螯合剂FC-9的合成路线Fig.2 Synthetic route of fluorescent chelator FC-9

图3 荧光螯合剂FC-9的晶体结构Fig.3 Crystal structure of fluorescent chelator FC-9

图4 FC-9的晶胞堆积图Fig.4 Packing of FC-9 in unit cell

2结果与讨论

2.1 FC-9的晶体结构

双功能荧光螯合剂FC-9通过对氨基水杨酸与邻氨基苯硫酚经环合反应制备得到(图2)，将其在乙醇中溶解，室温下静置5 d后可得到适合X-射线单晶测试的浅黄色晶体。在FC-9的晶体结构中(图3)，苯并噻唑环和与之相连的苯环构成了它的荧光部分，但二者并不完全共平面，它们之间的二面角为6.86°，这和FC-9结构类似的螯合剂2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-碘苯酚(HBXI)一样，且它的二面角比FC-9要小1.76°[10]。FC-9的苯并噻唑环的两个C-N键长并不相等[C(6)-N(1)0.137 9(2)nm；C(7)-N(1) 0.131 0(2)nm]，而与苯环相连的氨基氮的C-N键长[C(11)-N(2)0.136 5(3)nm]处于它们之间，它比与酚羟基相连的C-O键长[C(9)-O(1)0.1351(2)nm]稍长(表2)。此外，和HBXI相比，FC-9除了含有分子内的O-H…N氢键之外，还存在苯环上氨基与羟基形成的分子间N-H…O氢键，这两种氢键使得整个螯合剂分子形成了二维网络结构(图4和表3)。

2.2 荧光性质

在20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲体系中(pH=7.4)，FC-9(10 μmol·L-1)在室温和自然透光的条件下，5 d内其荧光强度几乎没有变化(图5A)。这表明FC-9的荧光是很稳定的，基本不受时间和光照的影响，这方面它要优于ThT(ThT对光敏感)[24]。在室温和pH值在3.0～8.0的范围内，FC-9的荧光强度也几乎保持不变，这使得在近生理的条件下它能够适应生命体中某种生理刺激所引起的pH值的变化(图5A插图)。不同的溶剂对FC-9的荧光强度影响很大(图 5B)。实验结果表明，FC-9在DMSO中荧光强度最大，在DMF、CH3OH、CH3COOCH2CH3中都有不同程度的荧光猝灭，而在CH2Cl2中基本完全猝灭。为尽可能减少有机溶剂对生物体系的影响并保证FC-9的溶解，在后续实验中将FC-9配制成含10%DMSO的水溶液。FC-9在10%DMSO的水溶液中的最大吸收波长为350 nm,最大激发波长(λex)和最大发射波长(λem)分别为350 nm和414 nm。FC-9对各种常见的金属离子几乎都没有什么荧光响应。如图6所示，等物质的量的FC-9(10 μmol·L-1)与各种常见的金属离子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+)作用后，其荧光强度基本没有太大的变化。

对于玉米产量来讲，一个重要的影响因素就是病害，其主要涉及到生物胁迫和非生物胁迫。利用遗传改良的手段来有效地改善玉米的抗逆性是一种较为经济有效的方法，特别是在如今，增强玉米抗逆性已经成为了玉米育种领域之中一个相当重要的课题。近年来，国内主要玉米产区出现了较为严重的天气灾害，给玉米生产带来了较为严重的影响。抗逆性育种非常重要，但目前还严重的不足，如抗旱品种、抗虫害品种的选育等都还未取得明显成果，直接影响到了玉米生产[1]。

图5 时间、pH值(A)和不同溶剂(B)对FC-9(10 μmol·L-1)的荧光光谱的影响Fig.5 Effect of time,pH values(A)and different solvents(B)on the fluorescence of FC-9(10 μmol·L-1)

图6 在20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液中(pH=7.4, VH2O/VDMSO=9),FC-9(10 μmol·L-1)对不同的金属离子(10 μmol·L-1)的荧光响应Fig.6 Fluorescent response of FC-9(10 μmol·L-1)to different metal ions(10 μmol·L-1)in 20 mmol·L-1Tris-HCl buffer(pH=7.4，VH2O/VDMSO=9)

2.3 FC-9与金属-Aβ聚集体的相互作用

Aβ是AD患者脑中老年斑的核心蛋白，其中Aβ40和Aβ42是主要的组分。我们发现FC-9与 Aβ40或Aβ42聚集体相互作用随时间的变化是不同的。FC-9与Aβ40聚集体相互作用在0.5 h时后荧光增强最多(图7A)，而其与Aβ42聚集体在10 min时荧光增强最多(图7B)，这主要是由于FC-9具有与ThT类似的苯并噻唑环状平面结构，因此它能识别Aβ40/Aβ42聚集体，这也印证了我们对FC-9分子的设计思想。因为Aβ42比Aβ40更容易聚集，所以FC-9与两种不同的Aβ聚集体作用后荧光增强到最大值的时间是不同的。随着反应时间的延长，两种反应体系的荧光强度都会下降到低于其配体的荧光，这可能是FC-9对Aβ40/Aβ42聚集体有抑制作用所导致的。在加入Cu2+或Zn2+到Aβ40/ Aβ42中反应2 d后，再将FC-9加入上述体系中反应2 d，我们发现金属-Aβ40/42聚集体的反应体系荧光强度比Aβ40/42聚集体的反应体系明显降低(图8)。作为一种螯合剂，FC-9此时发挥了螯合的功能。在较长的反应时间中，FC-9能螯合金属-Aβ40/ 42中的Cu2+或Zn2+，使得金属-Aβ40/42聚集体解聚，识别金属-Aβ40/42聚集体的FC-9的减少导致了反应体系的荧光减小。我们尝试用电位滴定法测试FC-9与Cu2+、Zn2+的结合常数，由于FC-9的溶解性不好，采用了含有10%DMSO的水溶液体系。但是，向FC-9中加入Cu2+或Zn2+进行滴定，即使是微摩尔数量级，反应过程中就逐渐产生了沉淀物，从而导致测不出FC-9与Cu2+、Zn2+的结合常数。参照文献，和FC-9结构类似的螯合剂2-(苯并[d]噻唑-2-基)-4-碘苯酚(HBXI)与Cu2+、Zn2+的稳定常数β分别为1020.29、1019.68，因此相对于金属-Aβ40/42而言(lgKCu-Aβ40/42=5～10，lgKZn-Aβ40/42=3～9)，FC-9容易螯合金属-Aβ40/42中的金属离子[10,25-27]。

图7 FC-9与Aβ40(A)或Aβ42(B)聚集体相互作用随时间的变化Fig.7 Interaction of FC-9 and Aβ40(A)or Aβ42(B)aggregates as a function of time

图8 FC-9与金属-Aβ40(A)和金属-Aβ42(B)聚集体反应2 d后的荧光变化Fig.8 Fluorescence change of FC-9 and Aβ40(A)(or Aβ42(B))aggregates reacted for 2 days

为了证实FC-9使金属-Aβ40/42聚集体解聚，我们又通过可溶性蛋白含量测定和浊度实验进行了验证。BCA蛋白分析法表明，Cu2+-Aβ40/42和Zn2+-Aβ40/42聚集体中可溶性的Aβ40/42含量比Aβ40/42聚集体少，说明Cu2+、Zn2+促进了Aβ40/42的聚集(图9)。加入FC-9到金属-Aβ40/42聚集体中后，Cu2+-Aβ40/42聚集体和Zn2+-Aβ40/42聚集体中可溶性的Aβ40/42含量都增加了，但可溶的Aβ40/ 42增加的程度都有限，说明FC-9的加入可能使得金属-Aβ40/42聚集体解聚了。浊度实验结果如图10所示，相对于新鲜的Aβ40/42，反应2 d后的Aβ40/42溶液的吸光度值变大，说明2 d后Aβ40/ 42形成了聚集体。加入Cu2+或Zn2+到新鲜的Aβ40/ 42中反应2 d后，溶液的吸光度值又明显增强，表明加入金属离子又使Aβ40/42的聚集程度增大。加入FC-9到金属-Aβ40/42中后，溶液的吸光度值有所下降，但没有下降到低于培养2 d的Aβ40/42聚集体，也说明FC-9能够螯合金属-Aβ40/42中的Cu2+或Zn2+，使得金属-Aβ40/42聚集体解聚。

图9 FC-9与金属-Aβ40(A)和金属-Aβ42(B)聚集体反应2 d后,用BCA蛋白分析法测定可溶性Aβ含量Fig.9 BCA protein analysis of soluble Aβ after FC-9 and metal-Aβ40(A)(or metal-Aβ42(B))aggregates reacted for 2 days

图10 FC-9与金属-Aβ40(A)和金属-Aβ42(B)聚集体反应2 d后的浊度实验Fig.1 0Turbidity test after FC-9 and metal-Aβ40(A)(or metal-Aβ42(B))aggregates reacted for 2 days

2.4 聚集体形态和构象

透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)能用来直接观测Aβ聚集体纳米级尺寸的聚集形态，可为分析它的各种形貌诸如无定形和纤维状等提供最为直观的证据。如图11所示，新鲜制备的Aβ40在Cu2+和Zn2+存在或不存在的情况下于37℃反应2 d后，均能观测到有规则的线状纤维形貌(图11A，B，C)。与Cu2+诱导的Aβ40聚集体相比，Zn2+诱导的Aβ40聚集体还发现有成团结块的形貌，这主要是因为Cu2+和Zn2+虽然都能诱导并加快Aβ40的聚集，但Zn2+诱导Aβ40的聚集的能力要比Cu2+大得多[28]。在加入FC-9到金属-Aβ40聚集体中反应2 d后，这些金属-Aβ40聚集体变小了，而且是一种无定形的状态(图11D，E)，这应该是FC-9与金属-Aβ40聚集体作用后，前者夺取了后者的金属离子，并使得后者解聚为Aβ40寡聚体或者单体，而且这可以从FC-9与金属-Aβ40聚集体作用的荧光测试和BCA蛋白含量分析等多种检测方法得到证实。

不同Αβ42样品的透射电镜结果与Aβ40样品类似。单独的Αβ42样品在37℃条件下反应两d后形成了纤维状的聚集体，随着Cu2+、Zn2+的加入，可观测到形成的金属-Αβ42网状纤维聚集体都比单独的Αβ42聚集程度大，说明Cu2+、Zn2+促进了Αβ42的聚集(图11F，G，H)。和Aβ40样品对比，Aβ42聚集体和金属-Aβ42聚集体的聚集程度更大，这又表明了Aβ42比Aβ40更易聚集。在加入FC-9到金属-Aβ42聚集体中反应2 d后，在Cu2+-Aβ42聚集体中观察到聚集体结构疏松了很多，而在Zn2+-Aβ42聚集体中观察到了小的无定形颗粒状聚集体(图11I，J)，这也表明了FC-9的加入使得金属-Aβ42聚集体解聚。

图11 不同Aβ40/42样品于37℃反应2 d后的透射电镜图片Fig.1 1TEM images of different Aβ40/42 samples after reacted for 2 days at 37℃

图12 FC-9加入或不加入金属-Aβ42聚集体的圆二色谱Fig.1 2CD spectra of metal-Aβ42 aggregates systems in the presence and absence of FC-9

圆二色(circular dichroism，CD)是研究稀溶液中蛋白质构象变化的一种快速、简单、较准确的方法。我们研究了将FC-9加入或不加入金属-Aβ42聚集体体系的圆二色光谱(图12)。测试的结果表明，在Zn2+和Cu2+的存在下，Aβ42在225 nm左右出现了其纤维特征的负吸收波段(β-折叠二级结构)[29]。加入FC-9到金属-Aβ42聚集体中后，表示β-折叠的特征的负吸收波段均上移，表明FC-9的加入使得具有β-折叠结构的Cu2+-Aβ聚集体和Zn2+-Aβ聚集体中的β-折叠结构的蛋白减少，这不但说明它们的构象都发生了改变，还暗示FC-9的加入可能使得金属-Aβ聚集体解聚了，其结果也与上述浊度和BCA蛋白质含量分析的测试结果一致。

2.5 细胞实验研究

将FC-9(10 μmol·L-1)加入到HeLa细胞中并共培养一段时间后，在紫外光下激发下(360～370 nm)，用倒置荧光显微镜可观察到细胞发浅黄绿色的荧光(图13)，这表明FC-9能够跨过细胞膜。事实上，和曾经进行了二期临床实验的螯合剂氯碘羟喹(CQ)一样，FC-9在理论上也完全符合严格的Lipinski类药标准和跨越血脑屏障的计算方法(表4)[30-31]。

图13 向HeLa细胞中加入FC-9的倒置荧光显微镜图片Fig.1 3FM images of HeLa cells exposed to FC-9(excited with UV light)

表4 FC-9和氯碘羟喹的Lipinski参数和lgBB数值Table4 Lipinski′s parameters and lgBB Values of FC-9 and CQ

图14 在FC-9存在或不存在的情况下,Aβ40和Cu2+-Aβ40聚集体在HeLa细胞体系中于37℃孵育24 h后的毒性Fig.1 4Cytotoxicity of Aβ40 and Cu2+-Aβ40 aggregates with and without FC-9 toward HeLa cells after incubation for 24 h at 37℃

用MTT方法测试了FC-9与金属-Aβ40聚集体在HeLa细胞体系中的毒性。结果如图14所示，在相同的条件下，单独的Aβ40、Cu2+和FC-9对HeLa细胞只显示很小的毒性，细胞活力依然大于90% (相对值为100%)。含有Cu2+的Aβ40毒性稍微高于Aβ40，细胞存活率下降。在有FC-9存在的情况下，Cu2+-Aβ40聚集体的毒性下降，细胞活力略有上升，这表明FC-9能在一定程度上抑制由Cu-Aβ40聚集体产生的毒性。

3结论

本文以硫磺素T为母体，将其与氯碘羟喹类似的螯合基团组合在一起，设计合成了一种识别和抑制Aβ聚集体的荧光螯合剂FC-9。在pH 3.0～8.0的范围内，它的荧光强度基本稳定，基本不受时间和光照的影响，而且与各种常见的金属离子作用其荧光强度也基本没有变化。FC-9能识别和解聚金属-Aβ40/42聚集体，它符合严格的Lipinski类药标准，能够跨过细胞膜，在一定程度上可抑制由Cu-Aβ40聚集体产生的毒性，这使得FC-9在检测细胞内的Aβ40聚集体和用于螯合治疗AD方面可能有潜在的应用价值。

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A Thioflavin T-Based Fluorescent Chelator Disaggregated Metal-Aβ Aggregates

ZHANG Yong1,2ZHANG Zhe1DONG Xiong-Wei1YIN Wen-Xing1ZHANG Dan1LIU Chang-Lin＊,1
(1College of Chemistry,Central China Normal University,Wuhan 430079,China)
(2College of Chemistry and Chemical Engineering,Hubei Polytechnic University,Huangshi,Hubei 435003,China)

A thioflavin T-based fluorescent chelator 5-amino-2-(benzo[d]thiazol-2-yl)phenol(FC-9)was synthesized and characterized.Its interaction with metal-Aβ aggregates and the change of morphology,conformation, cytotoxicity of the resulting Aβ aggregates were investigated.The results showed that FC-9 can not only recognize different Aβ40/Aβ42 aggregates but also disaggregate metal-Aβ40/Aβ42 aggregates.After the interaction between FC-9 and metal-Aβ40/Aβ42 aggregates,the morphology of aggregates changed from fibril to amorphousness,and their β-sheet conformation was also reduced.Moreover,the cell membrane penetration of FC-9 fulfilled common drug-like criteria,and it can inhibit cytotoxicity of the Cu-Aβ40 aggregates,indicating that it could have potential prospect in the treatment of Alzheimer disease.CCDC:960540.

Aβ aggregates;thioflavin T;fluorescent chelators;disaggregation

O626.25

A

1001-4861(2015)08-1495-10

10.11862/CJIC.2015.233

2014-10-31。收修改稿日期：2015-05-05。

国家自然科学基金(No.21302059，21271079，21072074)和湖北省教育厅青年人才(No.Q20134402)资助项目。＊