HPLC法测定清肺抑火片中栀子苷、大黄素、大黄酚的含量

赵子剑，殷望宇

(怀化学院 化学与化学工程系， 湖南 怀化 418008)

清肺抑火片是由明代龚延贤《寿世保元》中清肺抑火汤加减而制成的中成药，方由黄芩、栀子、黄柏、大黄、苦参、天花粉、知母、桔梗和前胡九味药组成，是临床疗效确切的咳嗽、发热、便秘治疗药［1］.目前清肺抑火片的质量控制研究虽已取得不少可喜成果，但仍存在缺点［2－8］，例如，质量控制仅有制剂通则项下检测内容，标准过于简单或不能同时测定多个成分，导致定量耗时且不经济.为了有效地控制产品质量，本文用HPLC 法同时测定了方中栀子苷、大黄素和大黄酚的含量.现报道如下:

1 仪器、试药

1.1 仪器

CBL9960A 超声波清洗器(上海科导超声仪有限公司);METTLER TOLEDOAG135 型电子分析天平(梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司);FW 型中药粉碎机;LC－15C 高效液相色谱仪，紫外检测器，Lcsolution 色谱工作站(日本岛津)等.

1.2 试药

清肺抑火片(批号53020994、53020995、53020996，0.6 g/片)由云南省曲靖药业有限公司提供;栀子苷对照品(批号110749－201115)，大黄素对照品(批号110756－200110)，大黄酚对照品(批号110796－200514)，以上对照品购于中国药品生物制品检定所;方中9 味药材购于怀化市怀仁大药房;甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯.

2 含量测定

2.1 色谱条件 色谱柱:Dikma Diamonsil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流量:1.0 mL/min，流动相为乙腈 (A)－0.1% 磷酸水溶液 (B)，梯度程序:0 ～15 min，15%A;15 ～20 min，15% ～25%A;20 ～25 min，25%～35% A;25 ～30 min，35% ～55% A;30 ～35 min，55% ～75% A;35 ～40 min，75% ～90% A;40 ～70 min，90%A.检测波长分别为238 nm (栀子苷)和254 nm (大黄素，大黄酚)［9］.

2.2 对照品溶液的制备［9］精密称取五氧化二磷减压干燥12 h 后的栀子苷、大黄素和大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含栀子苷30 μg、大黄素和大黄酚40 μg 的溶液，摇匀，即得栀子苷、大黄素和大黄酚对照品溶液.

2.3 供试品溶液的制备［10－11］取本品粉末(过三号筛)约0.1 g，精密称取，置于100 mL 容量瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过.精密量取续滤液10 mL，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液，即得清肺抑火片供试品溶液.

2.4 阴性样品溶液的制备 取缺栀子，大黄药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液.

2.5 系统适用性试验 分别精密吸取各对照品溶液，清肺抑火片供试品溶液，缺栀子，大黄的阴性样品供试液各20 μl，注入HPLC 仪，按“2.1 色谱条件”测定，结果见图1.由图1 可知，供试品与对照品色谱在相近的保留时间内(栀子苷tR=9.7 min，大黄素tR=52.8 min，大黄酚tR=61.9 min)有相似的色谱峰而阴性样品无这些色谱峰，且样品中栀子苷、大黄素、大黄酚与其他色谱峰均可达到基线分离，分离度均大于1.5，测定结果表明阴性样品无干扰.

图1 HPLC 色谱图

2.6 线性关系考察 精密吸取上述栀子苷对照品溶液(30 μg/mL)，分别取2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，以测得峰面积为纵坐标(Y)，线性回归.得栀子苷线性回归方程为y = 2 × 106x－5258.7，R2=0.9994;表明栀子苷在0.06 ～0.6 μg 范围内呈良好的线性关系.精密吸取上述大黄素、大黄酚对照品溶液(40 μg/mL)，分别取2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，以测得峰面积为纵坐标(Y)，线性回归.得大黄素线性回归方程为y = 3 × 106x +140008，R2=0.9998;大黄酚线性回归方程为y = 5 ×106x +23958，R2=0.9999;表明大黄酸、大黄素在0.08 ～0.8 μg 范围内呈良好的线性关系.

2.7 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按上述色谱条件操作，重复进样6 次，每次进样20 μl，测定其峰面积，算出RSD.结果栀子苷峰面积的RSD 为1.04%，大黄素和大黄酚峰面积的RSD 分别为0.16%和0.88%，实验结果表明，本法精密度良好.

2.8 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12 h 时进样，结果栀子苷峰面积的RSD 为1.12%，大黄素峰面积的RSD值为0.49%，大黄酚峰面积的RSD 值为0.38%.表明供试品溶液在12 h 内稳定.

2.9 重复性试验 取同一批号样品6 份，按上述供试品溶液制备方法，平行制样并测定，结果测得供试品中栀子苷平均含量为0.61905 mg/g，RSD =1.32% (n=6);大黄素平均含量为0.4308 mg/g，RSD =1.10%(n = 6);大黄酚平均含量为0.4860 mg/g，RSD =0.41% (n=6).说明该方法的重复性良好.

2.10 回收率试验 精密称取已知浓度的供试品0.25 g，置于具塞锥形瓶中.平行称定6 份.在6 份样品中分别精密加入栀子苷、大黄素、大黄酚对照品适量(相当于样品中这些成分含量的80%、100%、120%)，然后加甲醇60 mL，超声40 min.按上述色谱条件操作，测定这6 份供试品溶液中栀子苷、大黄素和大黄酚的含量，计算平均回收率及RSD 值.结果栀子苷的平均回收率为98.33%，RSD 为0.55%;大黄素平均回收率为97.43%，RSD 为0.50%;大黄酚平均回收率为97.73%，RSD 为0.87%.结果表明，本方法回收率良好.

2.11 样品测定 按上述样品溶液制备方法及色谱条件，测定3 份清肺抑火片样品，结果见表1.

表1 样品中栀子苷、大黄素、大黄酚的含量测定

3 讨论

本文用HPLC 法一次测定了清肺抑火片中栀子苷、大黄素、大黄酚的含量.该方法供试品溶液制备简便易行，专属性好，分离度符合要求，灵敏度高，稳定性好，可作为该制剂含量测定的方法.

在实验过程中还考察了0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min 等多种流速，结果发现当流速为1.0 mL/min 的时候，样品中目标成分的分离效果较好，各组分的分离度均能达到1.5 以上.在流动相选择的实验中，笔者比较了乙腈－0.1%磷酸溶液，甲醇－0.1%磷酸溶液，乙腈－水3 种流动相系统，结果以乙腈－0.1%磷酸溶液为流动相时各组分分离效果较好，基线较平稳.

［1］国家药典委员会．卫生部药品标准(中药成方制剂第二册)［M］．北京:人民卫生出版社，1990:248．

［2］李健，徐金波，陈妍，等．清肺抑火片的质控方法研究［J］．天津中医，2002，19 (3):52－54．

［3］李应芬，李照宏，朱正华．清肺抑火片质量标准的研究［J］．中成药，2008，30 (2):301－302．

［4］鲍长丽，傅红，包淑英，等．RP－HPLC 法测定清肺抑火片中栀子苷的含量［J］．中国中医药杂志，2005，13(3):616．

［5］叶秀金，宋粉云．HPLC 法测定清肺抑火丸中大黄的四种成分的含量［J］．中药新药与临床药理，2010，21(6):646－648．

［6］李玉仿．清肺抑火片的薄层分析［J］．天津药学，2002，14 (2):66．

［7］叶秀金，宋粉云．HPLC 法测定清肺抑火丸中大黄的四种成分的含量［J］．中药新药与临床药理，2010，21(6):646－648．

［8］张小慧，王瑞明，倪艳，等．清肺抑火片质量标准研究［J］．中国中医药信息杂志，2008，15 (5):47－48．

［9］国家药典委员会．中华人民共和国药典2010年版一部［M］．北京:化学工业出版社，2010:232;22．

［10］汪霞．RP－HPLC 法同时测定清肺抑火片中大黄3 种成分的含量［J］．中国药事，2008，22 (1):49－51．

［11］张立．HPLC 法同时测定金酸萍颗粒中大黄素、大黄酚的含量［J］．中国药师，2011，14 (3):425．