应用RAPD技术分析女贞种质资源的遗传多样性与遗传结构

赵峰,刘国民,李娟玲*,张恩华,张其文,符伟

1.海南广播电视大学,海南海口570208

2.海南大学苦丁茶研究所,海南海口570228

应用RAPD技术分析女贞种质资源的遗传多样性与遗传结构

赵峰1,刘国民2,李娟玲2*,张恩华2,张其文2,符伟2

1.海南广播电视大学,海南海口570208

2.海南大学苦丁茶研究所,海南海口570228

本研究采用RAPD分子标记技术对我国7个野生居群共121份女贞种质材料进行遗传多样性分析。10条有效引物对121份女贞种质材料进行RAPD-PCR扩增，共扩增出94条DNA谱带，其中80条为多态性带，占总扩增带数的85.11%，平均每个引物扩增出9.4条谱带。分析结果表明，供试女贞材料在物种水平上具有丰富的遗传多样性，有效等位基因数Ne=1.4344，Nei’s基因多样性H=0.2591，Shannon信息指数I=0.3959；但在居群水平上，女贞的遗传多样性水平较低，PPB=37.08%，Ne=1.2590，H=0.1455，I=0.2127。女贞居群内的遗传变异大于居群间的遗传变异，居群间遗传分化指数Gst=0.4067，总的遗传变异中有40.67%的变异存在居群间，有59.33%的遗传变异存在于居群内。女贞居群间基因交流有限，基因流(Nm)为0.7294＜1。

女贞;种质资源;遗传多样性;RAPD

女贞(Ligustrum lucidum Ait)系木犀科(Oleaceae)女贞属(Ligustrum）常绿灌木或小乔木，具有清热解毒，抗菌消炎，健胃消积，去腻醒酒，止咳化痰，生津止渴，提神醒目明目益智和抗辐射，抗衰老，活血脉，强心利尿，降压减肥，抑癌防癌，调节血脂等功效[1]。女贞是木犀科苦丁茶之重要种类之一，是一种珍贵的茶药两用植物，具有多种药用价值和保健功能。女贞主要功能成份有多糖类、三萜类、黄酮类、苯醇类、磷脂类等化合物[2-15]，对红细胞造血有促进作用，能加快血小板的流动性，减弱血小板之间的碰撞，使其不易粘连和聚集，更不易在血管内膜沉积，从而减缓和防止血栓形成，又可降低脂质内膜的沉积，改善老年人血小板的流动性，降低血液粘度，防治老年人的血栓性疾病和动脉粥样硬化[16]。

RAPD标记（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）是Williams和Welsh等于1990年利用PCR技术发展起来的一种DNA多态性标记。它是建立在PCR(Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、EB(溴化乙锭)染色后，在紫外透视仪上检测多态性。RAPD技术现已广泛应用于植物的遗传多样性、品种鉴定、系谱分析及进化关系等研究领域，但在女贞种质材料的遗传多样性及遗传结构等方面，目前未见有前人的研究报道。本研究采用RAPD分子标记技术，选取我国7个居群中的121份女贞种质材料，从DNA分子水平上探讨女贞种质资源的亲缘关系及遗传多样性。旨在通过这一工作为更加科学合理地保护与开发利用女贞种质资源提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料来源

从海南大学苦丁茶研究所种质资源圃收集的7个居群121份种质材料上，分别取嫩叶或嫩芽作为本实验的供试材料（表1）。

表1　用于RAPD分析的121份女贞种质材料及其来源Table 1 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait used for RAPD along with their origins

1.2方法

1.2.1总DNA的提取采用李娟玲[17]等的改良CTAB法提取121份女贞种质材料基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的完整性；稀释100倍，用紫外分光光度计测定230 nm、260 nm和280 nm的吸光度，即OD值，计算所提DNA的浓度及估测DNA的纯度。

1.2.2PCR扩增反应反应在icyclerTMThermal Cycler型PCR仪上进行。采用优化后的RAPD反应体系和扩增程序，即：每25 μL体积中，10×反应buffer 2.5 μL，25 mM的MgCl23.0 μL，0.5 μL dNTPs，Taq酶0.4 μL，引物1.0 μL，DNA模板2.5 μL。Taq DNA polymerase和4×dNTP mix均购自上海申能博彩生物科技有限公司，Operon系列引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成(表2)。

RAPD-PCR扩增程序94℃预变性4 min，然后按94℃变性30 s，38℃退火45 s，72℃延伸120 s，进行40个循环，最后72℃延伸10 min，16℃保存。每个反应重复一次。

1.2.3扩增产物的检测取8 μL扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，在Gel Doc XR型凝胶成像分析系统下照相并记录。以100 bp plus DNA Ladder（购自中科瑞泰北京生物科技有限公司）作为对照分子量标准。

1.2.4PCR扩增谱带的统计和分析将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”由此生成0和1原始矩阵，统计每个引物扩增出的总带数和其中的多态性带数，计算多态性带百分率（Percentage of polymorphic bands，PPB），PPB=多态位点数/位点总数。用NTSYS-PC(2.02j)软件中的SIMQUAL程序计算Jaccard遗传相似系数(Genetic similarity，GS)[18]，并获得遗传相似系数矩阵。计算公式：GSij=2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij指两个个体间共有的带数，Ni+Nj指两个个体所有带数之和；用NTSYS-PC(2.02j)软件中的SAHN程序和UPGMA(Unweighted pair group mean average)方法进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成系统树图。

应用POPGENE1.31软件在假定种群处于Hardy-Weinberg平衡状态下，对所供试的种质材料进行遗传参数分析，分别计算了观测等位基因数(Observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(Effective number of alleles,Ne)、Nei′s(1973)基因多样性指数(Nei′s gene diversity,H)、Shannon′s信息指数(Shannon′s infornation index,I)、多态性带百分率（Percentage of polymorphic bands,PPB），群体总基因多样性(Total gene diversity,Ht)、群体内基因多样性(Gene diversity within populations,Hs)、群体间的遗传分化系数(Coefficient of gene differentiation,Gst)、基因流（Gene flow,Nm）、Nei′s(1978)遗传距离(Genetic distance，D)和遗传一致度(Genetic identity，I)。

表2　RAPD所用的引物Table 2 The used RAPD primers with their sequences

2　结果与分析

2.1基因组DNA的提取与检测

用改良CTAB法提取121份女贞种质材料的基因组DNA，经用紫外分光光度计检测其OD值。结果显示，OD260/OD280均在1.8左右，表明干扰RAPD分析的多糖类和三萜类化合物等杂质含量低，所提取的基因组DNA纯度较高。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并与Lambda DNA/HindⅢ+EcoRⅠMarkers比较，片段无弥散现象（见图1）。

图1　部分女贞种质材料的总DNA琼脂糖凝胶电泳图M为Lambda DNA/HindШ+EcoRMarkersFig.1Agarose gelelectrophoresis of total DNAof the different germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait

2.2RAPD扩增结果

用上述的所选的10个引物对121份女贞种质材料进行RAPD扩增，可获得带型清可辨的DNA指纹图谱，其扩增结果见表3。在这121份种质材料中，10个引物共扩增出94条清晰可重复DNA谱带，其中80条为多态性条带，占总扩增条带数的85.11%(见表3)。平均每个引物扩增的带数为9.4条，大多数扩增条带的分子量在200 bp～2100 bp之间。

表3　引物序列及其多态性Table 3 The sequences of primers used and their polymorphism

2.3女贞不同地理来源材料间的遗传多样性分析

根据供试种质材料的起源地域，女贞种质材料可分为贵州湄潭、贵州台江县、湖南祁东步云桥镇、湖南祁东白鹤镇排山村、湖南祁东白鹤镇高原村、四川巴中市以及南京农大校园7个居群。基于RAPD数据，利用PopGene软件分析女贞7个居群的遗传多样性，其结果如表4所示。

遗传多样性分析结果表明，在物种水平上，女贞的遗传多样性水平较高，平均每个位点的多态位点百分率PPB=85.11%，有效等位基因数Ne=1.4344，Nei’s基因多样性H=0.2591，Shannon信息指数I=0.3959；但在居群水平上，女贞的遗传多样性水平较低，PPB=37.08%，Ne=1.2590，H=0.1455，I=0.2127。

Shannon信息多样性指数显示了各居群的遗传变异由高到低依次为南京农大校园居群＞湖南祁东步云桥镇居群＞湖南祁东白鹤镇高原村居群＞四川巴中市居群＞湖南祁东白鹤镇高原村居群＞贵州湄潭居群＞贵州台江县居群(见表2)。各居群间均遗传多样性差异较显著，其中南京农大校园居群的遗传多样性水平最高(PPB=55.32%,H=0.2069,Ne=1.3613，I=0.3046）。

表4　女贞居群的遗传多样性Table 4Genetic diversity of germplasm materials ofLigustrum lucidum Ait

2.4女贞居群间的遗传结构和遗传变异分析

基于RAPD分析数据，计算供试女贞种质材料总的遗传多样性(Ht)和居群内遗传多样性(Hs)，在此基础上计算不同居群间的遗传分化系数(Gst)(见表5)。女贞不同居群总的基因多样度Ht为0.2453，其中居群内的基因多样性Hs为0.1455；基因流(Nm)为0.7294＜1，表明女贞居群间基因交流有限。女贞居群间遗传分化指数Gst=0.4067，表明总的遗传变异中有40.67%的变异存在居群间，有59.33%的遗传变异存在于居群内。

表5　女贞居群基因多样性Nei’s分析Table 5 Nei’s(1987)genetic structure analysis amongLigustrum lucidum Ait

2.5女贞种质材料的聚类分析

根据对RAPD扩增条带分析的结果，采用UPGMA法对121份女贞不同居群种质材料进行分析，建立聚类分析图(如图3所示)。聚类分析结果表明，所有供试材料可显著地聚为四类群。第一类群中来自贵州省湄潭县和台江县的材料首先分别按地理来源的不同聚为两小类，然后再聚为贵州类群；来自湖南祁东县三个居群的种质材料聚为湖南类群，此类群中不同居群的材料间存在交叉聚类现象，表明湖南祁东县三个居群间有明显的基因交流；此外，来自四川巴中市的材料和南京农大的材料也分别聚为四川巴中类群和南京农大类群。可见，不同居群的差异以及起源地域差异都可以从聚类分析图中清晰地反映出来。

3　讨论与结论

3.1RAPD分子标记的可靠性

RAPD分子标记技术存在的最大问题是重复性不太高。但诸多实例证实，在应用过程中只要认真优化最佳的反应体系和程序设计，并保持同一反应体系和同一扩增程序，完全可以得到重复性好的结果，是一种较为有效的分子标记方法[19]。本研究的结果也表明，在严格按照本实验前期建立的最佳反应条件及程度进行反应所扩增出的DNA多态性良好、条带清晰，且重复性好。在进行结果分析时，虽然多态性位点越多，所得到的结果从理论上来说越可靠，但需要付出的人力物力也相应增加。此外，当多态性位点增加到一定程度，增加的位点对准确性的贡献已有限。Pejic等[20]、周泽扬等[21]、洪棋斌等[22]的研究结果基本相近，他们均认为多态性位点数达到或超过70个时，可得到较为可靠的信息。本研究发现，应用10条有效引物对121份供试材料进行RAPD扩增，共获得多态性DNA谱带有96条，以此为基础的分析结果已趋于稳定。此外，本文所获得的聚类结果与可以把不同的材料完全分开，也与材料的地理起源基本一致。因此，作者认为引物数为10时，分析的结果不再变化，本研究所得到的结果真实可靠地反映了供试女贞的遗传多样性。

图3　121份女贞种质材料的聚类分析图Fig.3 The RAPD cluster analysis dendrogram for 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait

3.2女贞的遗传多样性与遗传分化

Hamrick等[23]曾总结了662种植物的遗传多样性和遗传分化所得出的平均值为：PPB=51.3%，Na=1.97，H=0.150，Gst=0.228；而其中分布区较为广泛的物种的遗传多样性和遗传分化所得出的平均值为：PPB=67.8%，Na=2.11，H=0.257，Gst=0.033；女贞物种水平的遗传多样性水平参数分别为PPB=85.11%，Na=1.8511，H=0.2591，Gst=0.4067。与Hamrick等所得出的平均值相比，女贞的多态位点百分率，Nei’s基因多样性指数及遗传分化参数均明显偏高，说明女贞具有较高的遗传多样性。女贞类群间遗传分化指数Gst=0.4067，表明总的遗传变异中有40.67%的变异存在类群间，有59.33%的遗传变异存在于类群内，类群内的遗传分化大于类群间的分化。影响植物类群间遗传分化的因素很多，基因流一向被视为是使类群遗传结构均质化的主要因素之一，具有有限基因流的物种往往较那些具有广泛基因流的物种有较大的遗传分化[24]。女贞的基因流仅为0.7294＜1，表明女贞居群间基因交流有限。因此，有限的基因流可能是引起女贞类群间分化的主要原因之一。

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Application of RAPD Technology to Analysis on the Genetic Diversity and Structure of Ligustrum lucidum Ait

ZHAO Feng1,LIU Guo-min2,LI Juan-ling2*,ZHANG En-hua2,ZHANG Qi-wen2,FU Wei2
1.Hainan Radio and TV university,Haikou 570105,China
2.Kudingcha Research Institute,Hainan University,Haikou 570228,China

The genetic diversity of the 121 germplasm materials of Ligustrum lucidum Ait from 7 wild populations in China was detected by RAPD molecular markers in the study.10 primers were used to amplify samples of L.lucidum Ait.And 94 DNAbands were got,80 of which was polymorphic,with the percentage of polymorphic bands(PPB)of 85.11%.On average, 9.4 DNA bands were amplified by each primer.The results showed that there was rich genetic diversity in the species level, with Ne=1.4344,H=0.2591,I=0.3959;but lower at the population level(PPB=37.08%,Ne=1.2590,H=0.1455,I= 0.2127).The genetic variation in L.lucidum Ait populations was higher than that among populations.The coefficient of gene differentiation(Gst)was 0.4067,which showed that there was 40.67%of genetic variance among the populations,and 59.33%in the populations.there were limited gene interflows among the populations of L.lucidum Ait.The gene flow(Nm) was 0.7249＜1.

Ligustrum lucidumAit;germplasm resources;genetic diversity;RAPD

S571.1文献标示码:A

1000-2324(2015)02-0161-07

2014-10-27

2014-11-10

海南省教育厅基金资助项目(Hjkj2012-51);国家自然科学基金资助项目(39860048)

赵峰(1981-),女,山东章丘人,讲师,农学硕士,主要从事植物资源和饲料学研究.Email:928662418@qq.com

Author for correspondence.Email:ljl0728@126.com