绝经后女性催乳素裂解与高血压及心功能不全关系的研究

宋继洋，王楠，方砚， 曹云山

绝经后女性催乳素裂解与高血压及心功能不全关系的研究

宋继洋*，王楠，方砚， 曹云山

目的：探讨绝经后女性催乳素裂解与高血压及心功能不全的关系，为其发病机制和防治策略提供新的理论依据。

方法：本研究共入选受试者216例，其中甘肃省人民医院心内科绝经后女性高血压患者156例，包括高血压患者（高血压组）80例，高血压合并心功能不全患者（观察组）76例；选取同期体检健康的绝经后女性（对照组）60例。检测指标包括全长催乳素（23 kD PRL）、催乳素片段（16 kD PRL）、脂质过氧化物（LPO）、总抗氧化能力（TAS）及左心室射血分数（LVEF）、N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）、肌酐、尿酸、空腹血糖及体重指数（BMI），并进行统计分析。

结果：（1）各组间在年龄、肌酐、尿酸、空腹血糖及BMI等方面无显著性差异（P＞0.05）。（2）高血压组LPO显著高于对照组，TAS显著低于对照组；观察组LPO显著高于对照组和高血压组，TAS显著低于对照组和高血压组（P＜0.05）。（3）观察组23kD PRL显著低于对照组，16 kD PRL、16 kD PRL/23 kD PRL显著高于对照组。差异均有统计学意义（P＜0.05～0.01）。（4）经Pearson相关分析，LPO与23kD PRL呈负相关（r=-0.784 P＜0.01），与16 kD PRL呈正相关（r=0.807 P＜0.01）；TAS与23 kD PRL呈正相关（r=0.768 P＜0.01），与16 kD PRL呈负相关（r=-0.777 P＜0.01）; 23 kD PRL与LVEF呈正相关（r=0.852 P＜0.01），与NT-proBNP呈负相关（r=-0.832 P＜0.01）；16 kD PRL与LVEF呈负相关（r=-0.850 P＜0.01），与NT-proBNP呈正相关（r=0.814 P＜0.01）。

结论：催乳素裂解与绝经后女性高血压及心功能不全高度相关。

催乳素；脂质过氧化物；总抗氧化能力；氧化应激；高血压；心功能不全

Methods: A total of 216 post-menopausal female subjects were enrolled in our study and they were divided into 3 groups: Hypertension group, n=80 patients with essential hypertension, Hypertension + HF group, n=76 and Control group, n=60 postmenopausal women form regular physical examination. The full length (23 kD PRL), 16 kD PRL fragment, lipid peroxide (LPO), total antioxidant status (TAS), left ventricular ejection fraction (LVEF), NT-proBNP, creatinine, uric acid, fasting blood glucose (FBG) and BMI were examined and compared among different groups.

Results:①There were no real differences in age, creatinine, uric acid, FBG and BMI among groups, P＞0.05.②Compared with Control group, Hypertension group had increased LPO and decreased TAS; compared with Control group and Hypertension group, Hypertension + HF group had increased LPO and decreased TAS.③Compared with Control group, Hypertension + HF group showed lower level of 23KD PRL, higher level of 16KD PRL and the higher ratio of 16KD PRL/23KD PRL, P＜0.05-0.01. ④Pearson correlation analysis indicated that LPO was negatively related to

23KD PRL (r=-0.784, P＜0.01), positively related to 16KD PRL (r=0.807, P＜0.01); TAS was positively related to 23KD PRL (r=0.768, P＜0.01), negatively related to 16KD PRL (r=-0.777 P＜0.01); 23KD PRL was positively related to LVEF (r=0.852, P＜0.01), negatively related to NT-proBNP (r=-0.832 P＜0.01); 16KD PRL was negatively related to LVEF (r=-0.850, P＜0.01), positively related to NT-proBNP (r=0.814, P＜0.01).

Conclusion: PRL cleavage was highly related to the occurrence of hypertension and HF in post-menopausal female patients.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1058.)

全长催乳素（23 kD PRL）是一种由脑垂体分泌的全长为23kD的多肽激素，其主要功能是促进女性乳腺发育及泌乳。近年来，随着科学界对催乳素的研究越来越多，发现23 kD PRL可以进一步被蛋白酶水解成各种大小的片段。其中16 kD的催乳素片段（16 kD PRL）是一个主要的氨基末端催乳素片段，广泛存在于人类下丘脑、垂体、乳腺和肾脏中[1-3]，在体内外均具有抗血管活性[4-6]，目前国外研究多数认为16 kD PRL与围产期心功能不全有关[7-9]。关于16 kD PRL与绝经后女性高血压及心功能不全的关系尚少见文献报道。本研究主要通过检测绝经后女性外周血23 kD PRL、16 kD PRL、脂质过氧化物（LPO）、总抗氧化能力（TAS）、左心室射血分数（LVEF）及N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）水平，并进行相关性分析，初步探讨绝经后女性催乳素裂解与高血压及心功能不全的关系，旨在为临床治疗绝经后女性高血压、心功能不全患者提供新的理论依据。

1 资料与方法

临床资料：选取2013-03 至2014-03 甘肃省人民医院心内科住院绝经后女性高血压患者作为研究对象，共156例，依据《中国高血压防治指南2010》[10]及《中国心功能不全诊断和治疗指南2014》[11]诊断标准将其分为两组，其中高血压组 80 例，平均年龄（65.30±6.33）岁；高血压合并心功能不全组（观察组） 76例，平均年龄（67.67±5.71）岁。对照组选取同期体检健康的绝经女性 60例，平均年龄（66.86±6.46）岁。最终入选的216例受试者均排除：（1）继发性高血压；（2）急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、重度心血管瓣膜病变、严重心律失常；（3）自身免疫性疾病；（4）内分泌肿瘤；（5）严重肝病、肾功能衰竭；（6）2个月内发生的脑血管疾病（脑出血、脑梗死、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血等）；（7）长期服用激素类药物。

主要试剂与仪器：兔抗人催乳素抗体（Anti-Prolactin antibody）（英国abcam公司，克隆号：ab130316 英国），辣根酶标记山羊抗兔抗体IgG（北京中杉金桥生物技术有限 ），Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒（Thermo Scientific），TAS测定试剂盒（南京建成科技有限公司），LPO检测试剂盒（碧云天生物技术研究所） ，ECL Plus超敏发光液（北京索来宝科技有限公司），ChemiDoc XRS+凝胶成像仪（美国伯乐BIO-RAD公司），Olympus AU5400全自动生化分析仪，日本Alokaa10彩超诊断仪。

标本收集与处理：216例受试者入院第2天，于清晨空腹留取静脉血10 ml，4℃，2 000 r/min离心10 min，取血清分为四份分装于1.5 ml离心管中，-80℃冰箱保存待测。

蛋白免疫印迹法（Western blot）检测23 kD PRL和16 kD PRL：（1）样品稀释：取血清6 μl，加入24 μl PBS缓冲液混匀，将混匀后稀释5倍的血清稀释液用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒，测定蛋白浓度并计算上样体积保证上样量一致。由于血清中没有稳定表达的管家蛋白，因此参照文献[12]的方法以丽春红染色作为内参。（2）电泳蛋白样品制备：取30 μl稀释液，加入10 μl 4×上样缓冲液，混匀后100℃煮沸5 min，室温冷却后-20℃保存备用。（3）电泳分离：12 %SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔加入蛋白30 μg，电压80 V，电泳约40 min当条带跑至分离胶后调电压至120 V，继续电泳90 min左右，待溴酚蓝完全跑出分离胶时，停止电泳。（4）转膜：用0.22 μm NC膜，组装“三明治”结构，在电流200 mA条件下转膜90 min（冰水浴）。（5）5%脱脂奶粉封闭（27℃，1 h），孵育一抗（兔抗人Anti-Prolactin antibody 1:200 4℃过夜），15 ml TBST（4℃预冷）洗膜3次（10 min/次，恒温摇床摇动60 次/ min），孵育二抗（辣根酶标记山羊抗兔抗体 IgG 1:1000 27℃，1 h），恒温摇

床摇动40 次/min，洗膜3次（同上）。（6）Western blot检测：于暗室内膜上加入ECL Plus超敏发光液（0.125 ml/cm2膜），立即在ChemiDoc XRS+凝胶成像仪上测定，得到图像用Image J软件进行光密度值分析。

指标检测：硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定LPO[13]、化学发光法定量检测血清TAS。其他指标如肌酐、尿酸、空腹血糖等均由我院检验科负责在Olympus AU5400全自动生化分析仪上完成测定，LVEF由我院彩超室负责在日本Alokaa10彩超诊断仪上完成测定。

2 结果

各组间一般临床资料及检测指标的的比较（表1）：各分组在年龄、血肌酐 、血尿酸 、空腹血糖及BMI等方面差异无统计学意义（P＞0.05）。高血压组和观察组LVEF均低于对照组，观察组NT-proBNP水平高于对照组和高血压组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组间一般临床资料及各项检测指标的比较

表1 各组间一般临床资料及各项检测指标的比较

注： NT-proBNP：N末端B型利钠肽原；LPO ：脂质过氧化物；TAS ：脂质过氧化物；23 kD PRL：全长催乳素；16 kD PRL：16 kD的催乳素片段。与对照组比较*P＜0.05；与高血压组比较△P＜0.05

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氧化应激与高血压及心功能不全的关系：高血压组LPO显著高于对照组 ，TAS显著低于对照组;观察组LPO显著高于对照组和高血压组，TAS显著低于对照组和高血压组（表1）。差异均有统计学意义（P＜0.05～0.01）。经Pearson相关分析：LPO与LVEF之间呈负相关（r=-0.662，P＜0.01），与NT-proBNP呈正相关（r=0.615，P＜0.01）；TAS与LVEF呈正相关（r=0.684，P＜0.01），与NT-proBNP呈负相关（r=-0.712，P＜0.01）。

氧化应激与催乳素裂解的关系：经Pearson相关分析：LPO与23 kD PRL呈负相关（r=-0.784，P＜0.01），与16 kD PRL呈正相关（r=0.807，P＜0.01）；TAS与23 kD PRL呈正相关（r=0.768，P＜0.01），与16 kD PRL呈负相关（r=-0.777，P＜0.01）。

催乳素裂解与高血压及心功能不全的关系：Westen blot检测23 kD PRL和16 kD PRL显示，观察组23 kD PRL显著低于对照组（图1B）、16 kD PRL和16 kD PRL/23 kD PRL显著高于对照组（图1C、图1D）。差异均有统计学意义（P＜0.01）。经Pearson相关分析：23 kD PRL与LVEF呈正相关（r=0.852 P＜0.01），与NT-proBNP呈负相关（r=-0.832，P＜0.01）；16 kD PRL与LVEF呈负相关（r=-0.850，P＜0.01），与NT-proBNP呈正相关（r=0.814 ，P＜0.01）。

图1 蛋白免疫印迹检测23 kD PRL、16 kD PRL水平（n=216）

3 讨论

催乳素的主要功能是确保哺乳。一项来自于Georgiopoulos 等[14]的研究表明，当机体处于氧化

应激状态时，催乳素的一种裂解片段可能导致心血管疾病的发生。氧化应激是指机体内活性氧和抗氧化剂调控失衡，组织或细胞内氧自由基增多或清除能力降低导致活性氧（ROS）在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程[15]。大量研究发现当体内氧化与抗氧化作用调控失衡既氧化应激状态时，会导致细胞内信号转导和转录活化蛋白3（STAT3）缺乏，STAT3的缺乏会抑制超氧化物歧化酶活性的上调，随后活性氧的产生急速增加，活性氧的产生进一步激活了组织蛋白酶D的活性，从而将23 kD PRL裂解为16 kD PRL[7,16]。本研究主要通过测定绝经后女性外周血23 kD PRL、16 kD PRL、LPO、TAS、LVEF及 NT-proBNP，以发现绝经后女性催乳素裂解对高血压及心功能不全的影响，为其发病机制和防治策略提供新的理论依据。

Tabruyn 、Sabatel等研究发现催乳素裂解可通过调节细胞核因子-κB的表达，进而诱导血管内皮细胞SPRY蛋白1上调发挥抗血管活性[4,17]。Bajou等[18]证明裂解了的催乳素可通过结合一种已知的促进血管生成和生长的因子—纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1），并形成PAI-1三元复合物，即：PAI-1-尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）-uPA受体（uPAR）从而发挥抗血管生成作用,抑制血管生成和生长。活化状态的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和随后产生的一氧化氮是和血管内皮生长因子（VEGF）、缓激肽及乙酰胆碱等一样在介导血管生成、舒张和增加血管通透性的过程中起着非常重要地位的因子[19]，Gonzalez等[20]的研究发现PRL裂解产生的16 kD PRL可以通过抑制血管内皮细胞VEGF诱导的eNOS的活化、干扰血管内皮细胞内Ca2+的动员，从而抑制了eNOS的Ca2+依赖性激活途径，最终导致了血管收缩和生成障碍。上述研究证明随着PRL裂解，过多的16 kD PRL产生抑制了血管内皮的生成和修复、促进了血管收缩，总的结局不利于心力衰竭（心衰）的恢复。本研究发现高血压合并心功能不全患者中过高的16 kD PRL/23 kD PRL比值，也说明催乳素裂解与绝经后女性高血压及心功能不全高度相关，很可能参与了绝经后女性高血压及心功能不全的发生和发展。

大量研究发现氧化应激的发生与高血压病及其靶器官损害密切相关，其对心肌损害病理特征主要表现为心肌细胞排列紊乱，心肌间质充血，炎性细胞浸润，细胞核膜破坏、核仁裂解，线粒体变性，肌原纤维断裂等[21]。有报道发现高血压患者体内内源性抗氧化物质如谷胱甘肽S转移酶、谷胱甘肽过氧化酶、抗坏血酸及非蛋白硫醇等的水平明显低于血压正常者，并且与舒张压呈负相关[22]。Russo等[23]发现高血压患者脂质过氧化物升高，存在过氧化状态，提出氧化和抗氧化状态的不平衡是原发性高血压的发病机制。Lantos等[24]研究证实高血压患者的TAS浓度低于正常值范围，而在接受抗高血压药物治疗后有上升趋势。以上这些研究都表明除脂质过氧化物生成过量外，内源性抗氧化物质含量及活性的降低、总抗氧化能力下降都参与高血压及心功能不全的氧化应激过程，导致了心衰。本研究显示：高血压和观察组血清TAS水平明显低于对照组（P＜0.01），LPO水平明显高于对照组（P＜0.01），TAS与23 kD PRL之间呈正相关与16 kD PRL之间呈负相关，而LPO与23 kD PRL之间呈负相关，与16 kD PRL之间呈正相关，这些结果均提示氧化应激很可能是催乳素裂解的原因。

本研究发现当氧化与抗氧化能力失衡时，既机体处于氧化应激状态下，随着LVEF的降低，心功能不全患者外周血催乳素裂解明显增加。 23 kD PRL 明显减少 ， 16 kD PRL 明显增加 ，16 kD PRL/23 kD PRL比值明显升高。这一结果表明：氧化与抗氧化能力失衡很可能是触发催乳素裂解的一个关键点。催乳素裂解成具有抑制血管生成和启动凋亡的16 kD PRL形式这一过程使全身系统内皮细胞、心脏血管及心肌功能受损，损伤微血管系统，促进血管收缩，增强炎症细胞粘附到内皮细胞，降低心脏功能并促进心室腔扩大，导致心功能不全的发生和发展。

本研究为催乳素裂解的具体机制提供了新的线索，为绝经后女性高血压和心功能不全的发生机制和防治提供了新的视点，同时也为绝经后女性心功能不全患者激素替代治疗增添了新的证据。

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Relationship Between Prolactin Cleavage and the Occurrence of Hypertension, Heart Failure in Post-menopausal Female Patients

SONG Ji-yang**, WANG Nan, FANG Yan, CAO Yun-shan.
Department of Cardiology, Gansu Provincial Hospital, Lanzhou (730000), Gansu, China

Objective: To investigate the relationship between prolactin (PRL) cleavage and the occurrence of hypertension, heart failure (HF) in post-menopausal female patients.

Prolactin; Lipid peroxide; Total antioxidant status; Oxidative stress; Hypertension; Heart failure

2015-05-20）

(编辑：曹洪红)

甘肃省自然科学研究基金计划（1208RJZA110）

750000 甘肃省兰州市，甘肃省人民医院 心内科

宋继洋 硕士研究生 主要从事心功能不全相关研究 Email:songjiyang620xyz@163.com 通 讯作者：王楠 Email: wangnan2015@163.com*现宁夏医科大学临床医学院硕士研究生**Now is a Master Studeut at Clinical Medical Collese of Ningxia Medical University

R541

A

1000-3614（2015）11-1058-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015. 11.007