枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

李天芝，于新友，沈志强,2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州　256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州　256600）

枯草芽孢杆菌特异性PCR快速检测方法的建立和应用

李天芝1，于新友1，沈志强1,2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

参照GenBank中登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因，设计1对引物，扩增片段大小为460 bp的基因片段，该方法对枯草芽孢杆菌检测的灵敏性为1pg总DNA量，对枯草芽孢杆菌DNA的扩增结果为阳性，对照菌株扩增结果均为阴性，成功地建立枯草芽孢杆菌PCR检测方法，且该方法具有快速、灵敏度高、特异性强等优点。

枯草芽孢杆菌；16S rRNA基因；PCR；方法

枯草芽孢杆菌是一种可形成芽孢的好氧革兰氏阳性菌，该菌具有生长条件简单、耐温度变化、快速复活、快速生长和较强分泌酶等特点[1]。枯草芽孢杆菌是农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，在自然界中分布广泛，易于分离培养，对人畜无毒无害，能产生脂肽类、氨基酸和磷脂类等多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性，可改善动物肠道菌群结构，增强免疫力，促进生长发育，提高生产性能的作用[2-3]。近年来，国内外对于枯草芽孢杆菌在饲料加工方面的应用有大量相关报道。猪饲料中添加一定量的枯草芽孢杆菌，能增强仔猪免疫力、提高生长性能[4]。蛋鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌，即能增加种鸡的产蛋量和合格率，还能提高蛋的受精率、孵化率和健雏率[5]。肉鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌能改善其肠黏膜的抗氧化和免疫功能，从而提高肉鸡的生长性能[6]。枯草芽孢杆菌添加到奶牛饲料中，能显著提高奶牛产奶性能（P＜0.05）[7]。枯草芽孢杆菌添加到兔饲料中，能显著促进幼兔肠道免疫系统发育[8]。16S rRNA基因可作为细菌鉴定的一种靶基因，在巴氏杆菌、蛭弧菌和链球菌等细菌种属鉴定方面均有相关报道[9]。本研究根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因，设计引物，建立了枯草芽孢杆菌的PCR快速检测方法。

1　材料与方法

1.1菌种和试剂

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弗氏弧菌、地衣芽孢杆菌均由实验室保存。DNA回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，细菌基因组DNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，马丁肉汤培养基购自北京中海生物科技有限公司，rTaq聚合酶（Polymerase）购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2引物设计、合成

参照Genbank登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列（KF641815），用Primer primer5.0软件分析后，设计1对引物：16S rRNA-F：5'-GGACG⁃GCTGAGTAACACG-3'，16S rRNA-R：5'-GACAA CGCTTGCCACCTA-3'，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3PCR模板制备

将枯草芽孢杆菌菌种接种马丁肉汤液体培养基，置37℃培养箱中，培养18～20 h后，12 000 rpm离心2 min，PBS洗涤2次后，参照基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，提取细菌基因组DNA，同时提取其他几种对照菌的DNA作为模板。

1.4PCR反应体系和程序

分别对PCR反应的所用的引物浓度（0.2～1.2 μmol·L-1，每0.2 μmol·L-1为1个梯度）和退火温度（48～58℃梯度温度，每2℃为1个梯度）进行优化，最后确定的扩增体系为：10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，引物16S rRNA-F 1 μL、引物16S rRNA-R 1 μL，rTaq Polymerase 0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补至50 μL。反应程序为：95℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s，30个循环。

1.5PCR产物电泳检测和测序分析

PCR反应结束后，取产物5 μL，进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况，如果有目的基因扩增条带，用试剂盒回收后，与pMD18-T连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞内，提取初步鉴定为阳性的重组质粒，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测得序列与参照的枯草芽孢杆菌序列进行相似性比较。

1.6特异性检测

分别以提取的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弗氏弧菌、地衣芽孢杆菌等6种细菌的基因组DNA作为模板，采用已建立的方法进行PCR检测。

1.7敏感性检测

测定制备的枯草芽孢杆菌DNA浓度，然后做不同程度的稀释，使DNA的含量分别为10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1和0.1 pg·μL-1，分别取1 μL作为模板，按1.4优化的方法进行样品的加样和扩增反应。

1.8重复性检验

为验证该方法的重复性和稳定性，采用建立的方法，分别重复检测3次枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、弗氏弧菌、地衣芽孢杆菌的等6种细菌基因组DNA。

1.9检测方法的应用

采用已经建立的方法对本实验室已经分离和保存的42株疑似枯草芽孢杆菌检测，将扩增的PCR产物全部测序，并与GenBank公布的序列进行比对和序列分析。并同时参照文献进行检验，比较二者的符合性[10-11]。

2　试验结果

2.1PCR产物的检测和序列鉴定

PCR产物与pMD18-T连接后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果见图1。将测得序列与GenBank登录的序列进行比对分析，结果显示与枯草芽孢杆菌（登录号：KF641815）相应序列的相似性为100%。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，在460 bp处可见一条特异性目的条带，见图2。

2.2特异性检测

PCR特异性扩增检测结果表明，只有以枯草芽孢杆菌DNA为模板时才能扩增出460 bp的预期目的带，而对照菌株均无任何条带扩增，见图3。因此，建立的该PCR检测方法特异性良好。

图1　扩增产物测序结果

图2　枯草芽孢杆菌PCR扩增结果

图3　特异性实验

2.3敏感性检测

通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，分别取5 μL样品电泳，结果表明，该PCR方法可检测的枯草芽孢杆菌的DNA的最低量为1pg，见图4。

2.4重复性检验

重复性试验结果显示，3次重复试验结果无任何差别，说明该方法有很好重复性，见图5。

2.5检测方法的应用

经PCR检测和测序可知，42株疑似枯草芽孢杆菌分离菌中有7株为枯草芽孢杆菌，与采用相关国家标准的检测结果完全一致，见图6。

图4　敏感性实验

图5　重复性实验

图6　检测方法应用

3　讨论

传统的枯草芽孢杆菌实验室检测方法（病原分离与生化鉴定等）操作繁琐，耗时长，费用高，准确性差，不能满足基层工作者对枯草芽孢杆菌的快速和准确鉴定的需求。PCR方法以其特异性好、敏感性高和快速的特点已经广泛用于细菌菌种鉴别、疾病临床诊断和土壤微生物等多种领域。枯草芽孢杆菌存在于健康动物的肠道中，目前，已经从猪、鸡、牛等多种动物体内成功分离到了枯草芽孢杆菌，并对其特性做了鉴定，为微生态制剂的研究奠定了基础[11-13]。但从动物体内分离到的细菌众多，本试验枯草芽孢杆菌PCR检测方法的建立，能快速的从多种分离菌中，对枯草芽孢杆菌做出甄别和初步筛选，从而减少工作强度。枯草芽孢杆菌能抑制大肠杆菌、沙门氏菌多种肠道致病菌的生长，而为乳酸杆菌等有益菌的生长提供适宜的生长环境，从而保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力，同时枯草芽孢杆菌具有耐受高温、耐酸、耐挤压等特点，在饲料加工和储存过程中不易失活[14-15]。作为一种饲料添加剂，具有无毒无害、无残留等优点，能提高动物对饲料中营养物质的消化和吸收，增强动物抗病力，提高生产性能。采用本试验建立的枯草芽孢杆菌PCR检测方法，可对畜禽饲料中添加的枯草芽孢杆菌进行快速检测和鉴别。

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Establishment and Application of a Specific PCR Assay for Detection ofBacillus Suhtilis

LI Tianzhi1,YU Xinyou1,SHEN Zhiqiang1,2

（1.Shandong Lvdu Biological Technology Co.,Ltd.,Binzhou Shandong 256600,China 2.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Binzhou Shandong 256600 China）

A PCR assay for detection of Bacillus suhtilis was established using a pair of primers based on the 16S rRNA gene of Bacillus suhtilis.The size of the amplified product was 460 bp,and the specificity,sensitivity were studied.This method specifically amplified a fragment from Bacillus suhtilis with a detection limit of 1pg DNA of Bacillus suhtilis.Therefore the establishing PCR technique provided a sensitive,specific,fast and reliable method for diagnosis and epizootic study of the Bacillus suhtilis.

Bacillus suhtilis;16S rRNA gene;PCR;method

S852.61+6；S816.7

A

1001-0084（2015）12-0024-04

2015-11-16

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）；山东省现代产业技术体系家禽创新团队生产与环境控制创新团队项目（SDAIT-13-011-10）；山东省现代产业技术体系牛创新团队项目（SDAIT-12-011-12）；山东省现代产业技术体系毛皮动物创新团队项目（SDAIT-18-011-15）

李天芝（1985-），女，山东菏泽人，硕士，助理研究员，主要从事畜禽疾病诊断与防控研究。