猪伪狂犬病毒野毒株套式PCR检测方法的建立和应用

张 志，樊雅婷，吴发兴，刘 爽，董雅琴，邵卫星，段 纲，王树双，李晓成

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 云南农业大学，昆明云南 650201）

猪伪狂犬病毒野毒株套式PCR检测方法的建立和应用

张 志1，樊雅婷2，吴发兴1，刘 爽1，董雅琴1，邵卫星1，段 纲2，王树双1，李晓成1

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 云南农业大学，昆明云南 650201）

为建立能鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒株和疫苗株的实用方法，本文以疫苗株缺失的3.5kb片段为靶基因，设计了2对PCR引物，建立了能够特异性检测PRV野毒株的套式PCR方法。与常规PCR相比，该方法检测极限可达10个病毒拷贝/μL，是常规PCR的1000倍，并与猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象。在对临床150份样品检测时，套式PCR的阳性率为21.33%，常规PCR的阳性率为10%。这表明该方法具有特异性高、敏感性强的特点，是一种值得基层推广应用的快速诊断技术，可用于PRV的诊断和流行病学调查等。

猪伪狂犬病病毒；野毒株；套式PCR；检测方法

猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）是猪伪狂犬病（PR）的病原，属于疱疹病毒科，基因组为双股DNA分子，大小约150kb左右。猪是该病毒的传染源及长期贮存宿主[1]，PRV通常储存于猪的三叉神经节、嗅球和扁桃体内，在条件适合的情况下向外排毒，这使得PR的清除非常困难[2]。目前控制伪狂犬病的主要手段是接种疫苗，特别是接种基因缺失疫苗，并由此建立相应的野毒株与疫苗株的鉴别诊断方法，西方许多国家都依赖基因缺失疫苗进行免疫接种而制定了根除伪狂犬病的计划，并借此根除了PR[3]。我国从上世纪80年代开始就已经陆续使用PRV的基因缺失疫苗进行免疫，也陆续建立了一些PRV的血清学和病原学诊断方法，如乳胶凝集试验、血清中和试验、动物接种试验、

病毒分离和细胞培养试验、ELISA试验和PCR以及荧光PCR试验等[2，4-6]，尽管方法在应用时发挥了巨大的作用，但是由于我国生猪养殖模式多样，管理水平不一，诊断方法或精度不高、敏感度不够，或昂贵难以普及和应用，这些因素都导致了PRV的隐性带毒和扩散居高不下[7，8]。为更好地监测生猪体内PRV野毒的潜伏感染，提高检测PRV的敏感性，本文以疫苗株缺失的US区3.5kb片段为靶基因，建立了检测PRV野毒感染的套式PCR方法，并在生产实际使用，取得了较好的效果。

1 材料与方法

1.1 病毒与病料

PRV强毒株MinA，PRV疫苗毒株Bartha-K61均由中国动物卫生与流行病学中心保存；猪的临床样品150份，采自我国华南地区部分猪场。

1.2 主要试剂与酶

质粒提取试剂盒购自Promega公司；DNAzol购自invitrogen公司，pMD-18-T 载体、2×GC BufferⅠ、LA-Taq、Ex-Taq、rTaq等均购自Takara公司。

1.3 引物 针对PRV gE基因设计引物及探针并由上海生工生物工程有限公司合成，引物及探针序列见表1。

1.4 病毒DNA提取

表1 本试验所用引物

根据DNAzol说明书从PRV病毒细胞培养物或组织中提取总DNA，-20℃保存备用。

1.5 PCR反应体系及程序

套式PCR第一次扩增使用25 μL反应体系：Takara Taq 0.25 μL，2×GC BufferⅠ 12.5μL，dNTP Mixture 4 μL，PRV-1F 0.5 μL，PRV-1R 0.5 μL，DNA 3 μL，H2O 4.25 μL。扩增条件为：95℃预变性4 min； 95℃30s、59℃30s、72℃1.5min，30个扩增循环：最后72℃延伸10min。第二次扩增同样为25μL反应体系：Takara Taq 0.25 μL，2×GC BufferⅠ 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，PRV-F 0.5 μL，PRV-R 0.5 μL，一扩产物 1 μL，H2O 6.25 μL。 扩增条件为：95℃预变性4 min； 95℃30s、58℃30s、72℃30s，30个扩增循环；最后72℃延伸10min。常规PCR反应体系为25μL：Takara Taq 0.25 μL，2×GC BufferⅠ 12.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，PRV-F 0.5 μL，PRV-R 0.5 μL，DNA 3 μL，H2O 4.25 μL。扩增条件与套式PCR的第二次扩增相同。

1.6 套式PCR检测方法影响因素筛选和确立

以MinA株为扩增模板，分别用rTaq、Ex-Taq、LA-Taq等3种酶配合使用其生产厂家自带的10×Buffer缓冲液进行扩增，比较3种酶的扩增效果差异。再更换2×GC buffer缓冲液，分别使用原来的酶和相关反应体系进行扩增，比较缓冲液对扩增效果的影响。然后在不同的退火温度下（55℃、58℃、60℃、62℃、64℃）分别进行套式PCR的扩增，比较退火温度对扩增效果的影响。

1.7 标准质粒样品制备

以MinA株为模板，将引物PRV-1F/1R扩增的目的片段克隆到 pMD18-T载体转化到 DH5α中，摇菌提取质粒，经鉴定正确后，测定质粒浓度（拷贝/ μL），-20℃保存备用。

1.8 敏感性检测

将阳性质粒10倍梯度稀释至1×106拷贝/ μL ～1×101拷贝/μL ，以此为模板进行荧光定量PCR、套式PCR和常规PCR检测，比较套式PCR方法与常规PCR方法之间的敏感性差异。

1.9 特异性试验

分别提取CSFV、PRRSV、PCV2和TGEV的

病毒核酸，用本方法分别进行检测，观察是否可以同时检测到其他病毒，以确定套式PCR方法的特异性。

1.10 样品检测

对华南地区猪场送检的150份组织样品以及实验室保存的PRV强毒及疫苗毒的细胞培养物样品进行处理，提取总DNA，分别用套式PCR及常规PCR方法进行检测并对检测结果进行比较，检验套式PCR方法在临床应用可行性。

2 结果

2.1 影响套式PCR检测方法因素筛选和确立

以MinA株为扩增模板，分别用rTaq、Ex-Taq、LA-Taq等3种酶及各厂家提供的相应缓冲液进行扩增，结果发现，Ex-Taq和LA-Taq能扩增出目的条带，但很弱，且LA-Taq酶比Ex-Taq酶的扩增效果略好，而 rTaq根本扩增不出特异性条带，显然3种酶中以LA-Taq的效果最佳。将缓冲液更换为2×GC buffer进行扩增，结果3种酶都能扩增出特异性条带，而且条带比常规缓冲液扩增的条带更亮，表明如果用不同的酶分别与2×GC buffer缓冲液配对进行扩增，其效果都比较好，故此后的扩增反应均采用LA-Taq酶。当使用不同的退火温度时，使用LA-Taq酶，采用2×GC buffer缓冲液，结果发现不同的温度均能扩增出明亮的特异性条带（图1），表明退火温度对扩增结果影响不大。

2.2 敏感性试验

图1 套式PCR检测条件筛选

取用引物PRV-F5/R16制备的阳性质粒，测定其浓度为1.61×108拷贝 /μL，按比例将其倍比稀释 成 1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，1×101，1×100拷贝 /μL的标准品，分别使用常规PCR与套式PCR等2种方法进行检测，结果显示常规PCR的检测极限是1×104拷贝 /μL（图2），而套式PCR能检测出的最低浓度为1×101拷贝 / μL（图3），可见套式PCR比常规PCR的检测敏感性高1000倍。

2.3 特异性试验

图2.常规PCR敏感性检测PCR扩增结果

图3 套式PCR敏感性检测PCR扩增结果

分别提取PRV、CSFV、PRRSV、PCV2和PPV等5种不同病毒核酸，并进行套式PCR，结果只有PRV扩增出特异性条带，其余病毒均未扩增出（图略），表明建立的套式PCR方法具有良好的特异性。

2.4 临床样品的检测结果

为更准确比较套式PCR方法和常规PCR方法的实用性，运用本文建立的套式PCR和常规PCR

分别对华南地区的150份屠宰场样品进行检测，同时用本实验室保存的PRV强毒株样品（MinA）及疫苗毒株样品（BK-5）作为对照。用常规PCR方法从中检测出阳性样品15份（图4），阳性率为10%，而用套式PCR方法从中检测出32份（图5）（含常规PCR的15份阳性样品），阳性率为21.33%，表明套式PCR方法确实比常规PCR敏感和特异。当样品中浓度较低时，如8、9号样品，常规PCR仅勉强能检测到特异性条带，但套式PCR均可以检测到一条特异明亮的条带，说明即使样品中存在较低浓度的病毒，仍然可以通过方法扩增出易于判定的明亮条带，大大提高了诊断敏感性。

3 讨论

图4 猪场样品的常规PCR检测情况

图5 猪场样品的套式PCR检测情况

猪伪狂犬病（PR）是一种相对较老的疫病，其病原PRV的诊断方法较多，除了经典的病毒中和试验、细胞培养等方法以外，近年来随着分子生物学技术的发展，ELISA和PCR方法都已经成为PRV常用的诊断方法，如针对TK、gB、gG、gE、gI等多种基因的PCR以及荧光PCR诊断技术[9-12]。但鉴于PRV特殊的组织感染嗜性以及PRV基因组中G/C含量特别高的原因，即便是常规的PCR方法想要获得良好的试验结果也较为困难，尤其对于基层市县一级的实验室来说，建立一种简单特异的PCR诊断方法十分必要。

PCR是一种敏感性和特异性较高的诊断方法，其影响因素较多，如缓冲液成分、酶的成分、退火温度等，本文在研究中发现，就扩增PRV的目的基因而言，缓冲液的成分对扩增结果影响最大，试验中发现将酶配套的缓冲液更换为GC缓冲液后更有利于目的基因的扩增，另外酶的选择也影响靶基因的扩增效果，当选择rTaq酶时，扩增的条带就稍显模糊，而用LA-Taq时，扩增的条带比较清晰而特异。

本文建立的套式PCR方法，由于其扩增的目的基因为PRV野毒株所特有片段，因此，可以鉴别野毒株和疫苗株，利用该方法可以达到清除PR野毒的目的，具有广阔的市场应用前景。本文的研究结果还显示，本文建立的套式PCR诊断方法的检测极限可达101拷贝数/μL，与用荧光PCR方法的检测极限同一个等级[9]，远高于常规PCR的检测极限。在150份临床样品检测中，常规PCR检测的PRV阳性率仅为10%，而套式PCR的检测阳性率为21.33%，显然，套式PCR方法足以满足常规流行病学调查和病原检测。从特异性来看，本方法不与猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等产生交叉反应，表明本方法确实是一种特异高效的诊断方法。

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国家首席兽医师张仲秋会见蒙古国食品与农业部副部长巴特罩力格

农业部新闻办公室 4月22日，国家首席兽医师张仲秋会见了蒙古国食品与农业部副部长巴特罩力格，双方就中蒙畜牧兽医领域的合作深入交换了意见。

张仲秋表示，中蒙两国有着良好的农业合作关系，双方在畜牧业、跨境动物疫病和农业科技等领域开展了富有成效的合作。希望两国今后进一步加强兽医领域的合作，经常交流口蹄疫等重大动物疫病防控经验，积极探讨建立双边跨境动物疫病防控合作机制，促进两国农产品贸易健康发展。巴特罩力格完全赞同张仲秋对两国农业合作的评价和建议，并愿意与中方共同努力，不断深化双边农业交流与合作，共同促进两国农业的发展。

亚洲猪病防控技术培训班在北京举办，国家首席兽医师张仲秋出席会议并致辞

农业部新闻办公室 4月13—17日，农业部兽医局与世界动物卫生组织（OIE）在京联合举办“亚洲猪病防控技术培训班”，国家首席兽医师张仲秋、OIE亚太区代表处钉田博文先生出席会议并致辞。

目前，亚洲地区生猪疫情复杂，不同国家和地区之间的防控和诊断能力差距较大，这不但影响了亚洲整体猪病的防控，也对我国生猪产业发展形成潜在威胁。为提高区域防控水平，2014年我国倡议启动了“亚洲猪病防控项目”。本次培训是该项目框架下的一项重要活动，旨在发挥我国高致病性猪蓝耳病、口蹄疫等猪病防控技术优势，提高区域内实验室诊断能力，为逐步控制重大生猪疫病奠定基础。

张仲秋表示，希望区域内猪病参考实验室和各成员国家级兽医诊断机构建立实验室信息共享平台，逐步完善区域内猪病诊断实验室合作网络，促进疫病诊断及整体防控能力提升。

本次培训由中国动物疫病预防控制中心承办，来自农业部兽医局、中国动物疫病预防控制中心和OIE亚太区代表处、柬埔寨、印度尼西亚等9个国家和地区的代表参加了培训。

Construction and Application of a Nest PCR Assay for Identifi cation of Field Pseudorabies Virus Strains

Zhang Zhi1，Fan Yating2，Wu Faxing1，Liu Shuang1，Dong Yaqin1，Shao Weixing1，Duan Gang2，Wang Shushuang1，Li Xiaocheng1
（China animal health and epidemiology center，Qingdao 266032；2. Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

To differentiate the fi eld and vaccine pseudorabies virus （PRV）strains，a nest PCR assay was constructed by designing two nested primers based on the 3.5 kb target gene deleted in PRV vaccine strain. The detection limit of the nest PCR assay was up to 10 virus copies/μL，without cross-action with other viruses such as classical swine fever virus，porcine reproductive and respiratory syndrome virus，porcine parvovirus and porcine circovirus，while the routine PCR detected only 104virus copies/μL. Both the developed nest PCR assay and the routine PCR assay were used to test 150 fi eld samples resulting in 21.33% and 10% positive rate respectively. The results indicated that this method was of high sensitivity and specifi city and can be widely used for PRV diagnosis and investigation.

pseudorabies virus；fi eld stain；vaccine strain；nest PCR；identifi cation

S852.65

A

1005-944X（2015）05-0073-05

科技基础性工作专项（2012FY111000）；青岛市民生计划项目（13-1-3-91-nsh）