山东部分生猪屠宰场屠宰环节沙门氏菌污染状况分析

刘鲜鲜，王君玮，王 娟，赵建梅，盖文燕，孙佳怡，邹 明，黄秀梅，曲志娜

（1.中国动物卫生与流行病学中心 农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室（青岛），山东青岛 266032；2.青岛农业大学，山东青岛 266109）

山东部分生猪屠宰场屠宰环节沙门氏菌污染状况分析

刘鲜鲜1，2，王君玮1，王 娟1，赵建梅1，盖文燕1，孙佳怡2，邹 明2，黄秀梅1，曲志娜1

（1.中国动物卫生与流行病学中心 农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室（青岛），山东青岛 266032；2.青岛农业大学，山东青岛 266109）

[目的] 初步调查分析山东部分地区生猪屠宰环节沙门氏菌污染状况和血清型分布，了解生猪屠宰环节沙门氏菌的动态变化。[方法] 采集鲁东部、东北部、中部、西部和西南部地区不同规模屠宰场生猪屠宰环节样品共1012份，分离疑似沙门氏菌并利用PCR方法和血清凝集反应进行鉴定，单因子血清进一步进行血清型分析。[结果] 共分离鉴定沙门氏菌202株；鲁东、东北、中部、西部和西南部地区的沙门氏菌污染率分别为27.2%、12.6%、34.6%、12%和13.5%；沙门氏菌分离株共有9种血清型，以德尔卑（S.derby）、鼠伤寒（S.typhimurium）、汤卜逊（S.thompson）为主。[结论] 山东地区部分屠宰场生猪屠宰环节存在较严重的沙门氏菌污染现象，应加强屠宰环节致病菌监测，并在屠宰全程严格执行良好生产规范。

沙门氏菌；生猪；屠宰环节；血清型；细菌污染

沙门氏菌（Salmonella）是肠杆菌科最常见的人畜共患病原菌之一。沙门氏菌属型别繁多，抗原复杂，目前为止已鉴定的血清型达2500多种，我国已检出290多种[1]，且新的血清型仍不断被发现。人感染沙门氏菌多由鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等常见的几种沙门氏菌血清型引起，也有一些食源性疾病由德尔卑沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌等引起。

目前，由沙门氏菌引起的食物中毒事件位居世界前列[2]。据统计，我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起，其中90%以上的沙门氏菌感染都是由肉类动物性食品引起，而猪肉已被认定为人感染沙门氏菌的主要来源之一[3]。本研究旨在对山东地区部分生猪屠宰企业屠宰环节中沙门氏菌进行分离鉴定，对鉴定菌株进行血清型分布分析，以便了解本地区屠宰环节沙门氏菌的污染状况和优势血清型分布，为进一步开展沙门氏菌分子流行病学分析、污染肉品风险评估及制定控制规范提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源。2014年3月至12月，自山东部分地区不同规模生猪屠宰场主要屠宰环节采集的样品，共1012份。其中，鲁东部地区305份，东北部地区182份，中部地区133份，鲁西和西南地区分别为192份和200份。样品采集、标记后，放入运输培养基，冷藏送至实验室待检。

1.1.2 对照菌株。肠炎沙门氏菌CICC21482为阳性对照菌株，大肠杆菌ATCC25922为阴性对照菌株，均由本实验室保存。

1.1.3 阳性血清。沙门氏菌属O抗原诊断血清、分型血清，购自泰国S&A公司。

1.1.4 主要试剂。缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液基础（TTB）、沙门氏菌显色培养基（法国博赛科玛嘉）、胰蛋白大豆肉汤、细菌琼脂粉、MH肉汤，均购自北京陆桥生物技术有限公司。GoTaq Green Master Mix 酶、DNA Marker DL1000、PCR反应试剂，购自Takara。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与培养。吸取100μL样品接入BPW预增菌液中，置37℃恒温摇床培养8～12h。然后，吸取200μL预增菌液接入现配制的TTB增菌液中，42℃恒温培养箱培养18～24h。取增菌液适量接种于沙门氏菌显色培养基，37℃培养18～24h后，挑取紫色和类似紫色的可疑单个菌落转接种至胰蛋白大豆胨肉汤中纯培养。将纯培养物接种于胰蛋白大豆胨平板，37℃培养18～24h，备用。

1.2.2 细菌鉴定

1.2.2.1 引物设计 参照文献[4]发表的沙门氏菌保守基因invA引物序列，用primer5.0设计软件进行引物设计，用于扩增大小约284 bp的基因片段。上游引物（P1）：5’-GTGAAATTATCG CCACGTTCGGGCAA-3’；下游引物（P2）：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2.2.2 PCR鉴定 采用热裂解法[5]提取细菌DNA。反应体系为25μL：Green mix 12.5μL，去离子水 9.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板2μL。反应条件：95℃预变性5min；94℃ 30s，64℃30s，72℃ 30s，30个循环。产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳成像后，观察结果。

1.2.2.3 血清学鉴定 按照文献[6]中的方法和产品说明书，用沙门氏菌属O抗原诊断血清对PCR鉴定阳性的沙门氏菌分离株进一步进行确定，同时用生理盐水作对照。被A～F多价O血清凝集的菌株，进一步用O型单因子血清作玻片凝集试验进行分型确定。

2 结果

2.1 沙门氏菌分离与培养

分离菌株在沙门氏菌显色培养基上为紫色或淡紫色，胰蛋白大豆胨平板上为白色光滑菌落。革兰氏染色结果为阴性短杆菌。初步判定为疑似沙门氏菌菌株，需进行进一步的鉴定分析。

2.2 菌株鉴定结果

PCR检测结果表明：提取分离纯培养的202株疑似沙门氏菌DNA进行PCR扩增后，经1.2%

琼脂糖凝胶电泳成像，均出现284bp大小的目的片段。部分代表性菌株PCR电泳条带见图1。PCR阳性菌落进一步用沙门氏菌O抗原诊断学清确证，均出现凝集。

图1 沙门氏菌invA基因 PCR检测结果

2.3 血清型分型

对202株经PCR鉴定和多价O血清确定为阳性的菌株，利用沙门氏菌单因子血清进行血清分型。结果共鉴定出9种血清型。检出率较高的3种主要血清型分别为德尔卑沙门氏菌（S.derby）（n=80）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）（n=56）、汤卜逊沙门氏菌（S.thompson）（n=34）。不同地区优势血清型差异较大。其中，鲁东部地区屠宰环节沙门氏菌优势血清型依次为S.typhimurium（n=32）、S.derby（n=11）、S.agona（n=2）、S.enteritidis（n=1）；西部地区优势血清型除S.typhimurium（n=19）、S.derby（n=6）外，S.tsevie（n=2）、S.agona（n=1）、S.lagos（n=1）和S.oritamerin（n=1）也有分布；东北部地区以S.derby（n=26）为主，其次为S.lomita（n=2）和S.typhimurium（n=4）；中部地区以S.thompson（n=31）为优势血清型，而西南部地区的沙门氏菌优势血清型为S.derby（n=34）。除上述定型菌株外，还有10株沙门氏菌不能定型。

2.4 沙门氏菌污染状况统计分析

山东地区部分屠宰场生猪屠宰环节沙门氏菌总体污染率为19.8%（202/1021）。不同地区沙门氏菌的污染有较大差异，其中，鲁中部地区污染检出率最高（34.6%），西部和东北及西南地区相对较低（图2）。

图2 山东省内不同地区屠宰环节沙门氏菌污染比较

在进入屠宰流程后的不同采样环节中，除鲁东部和中部地区有较大差别外，其他三个地区的淋浴后体表至出库前肉表面以及剥皮、劈半工具上沙门氏菌污染差异不明显。采样的5个地区生猪肛门拭子沙门氏菌检出率差异较大，分别为10%～50%。不同环节沙门氏菌污染状况见图3。

图3 山东部分地区生猪屠宰环节沙门氏菌污染状况比较

3 讨论

生猪屠宰环节是肉品受致病菌污染的关键风险点之一。本研究自2014年3月至12月间从鲁东部地区采样305份，分离出沙门氏菌83株，分离率为27.2%；鲁东北部地区采样182份，分离出沙门氏菌23株，分离率为12.6%；鲁中部地区采样133

份，分离出沙门氏菌46株，分离率高达34.6%；鲁西部地区采样192份，分离沙门氏菌23株，分离率为12.0%；西南部地区采样200份，分离沙门氏菌27株，分离率为13.5%。共采集样品1012份，分离出沙门氏菌202株，总分离率为19.8%。从屠宰环节污染检出情况看，与李郁[7]对合肥五个定点生猪屠宰场进行的沙门氏菌污染状况调查较接近，500份生猪体表样本及200份胴体肉样中沙门氏菌检出率分别为24.2%和17%。而普遍高于侯小刚等[8]对四川省猪肉生产链中屠宰场胴体肉样进行的沙门氏菌污染状况调查结果（胴体污染率为10.71%）。说明尽管由于屠宰场规模、环境、日屠宰量以及屠宰人员等因素不同，不同区域不同屠宰场的污染率有差异，但屠宰环节存在沙门氏菌污染现象不容忽视。

由于不同地区不同规模的生猪屠宰场的主要环节有所不同，采样时共有的主要屠宰环节统一采样10份，且肛门拭子按照屠宰场的日屠宰量不同按比例采样。剥皮后冲洗水、劈半后冲洗水、去蹄刀具、开膛工具、烫洗水、屠宰场墙壁等由于不同屠宰场采样流程不同，为方便叙述统一归为其它环节。从本研究结果看，2014年度选取的鲁东、鲁东北、鲁中、鲁西和鲁西南地区生猪屠宰场屠宰环节沙门氏菌的污染率较高，不同屠宰环节的污染率也存在一定差异。与猪肉产业链中其他环节如猪养殖场、销售市场的沙门氏菌污染率相比，也有很大的差异。张玮等[9]对安徽部分猪场生猪调查的结果表明沙门氏菌检出率为4.07%，其中安庆地区猪场检出率达到18.89%。与侯小刚等[8]四川部分地区猪肉产业链研究发现屠宰场和销售市场猪肉沙门氏菌污染率分别为10.71%和10%相近，高于张静[10]等对某定点生猪屠宰场的研究中猪胴体体表5%的分离率。

生猪屠宰不同环节沙门氏菌的污染率不同，肛门拭子、脱毛后胴体表面、剥皮后胴体表面、劈半前后胴体表面以及剥皮工具的污染率较其他环节高，分别为29.3%、46%、48%、32%、40%、32%。肛门拭子沙门氏菌大多为生猪本身带有或从待宰圈及运输车等感染或污染。携带率较高则可能造成在屠宰过程中污染其他健康猪只，造成严重的交叉污染现象。本研究发现剥皮后胴体表面的沙门氏菌污染率最高，且比剥皮前沙门氏菌的污染率高出22%，加之剥皮工具也具有较高的污染率，分析原因可能为由剥皮工具消毒次数较少或一些小规模的屠宰场根本就不消毒而造成的严重污染。不同地区，由于屠宰环境、日屠宰量、屠宰场规模的不同，每个屠宰环节的沙门氏菌污染率也有所不同，鲁东北、西部和西南部地区由于屠宰场规模差异不大，日屠宰量较接近以及屠宰人员流动性小，屠宰环节沙门氏菌的污染状况相似。鲁东部和中部地区由于生猪屠宰量较大，生猪屠宰场较多且分布集中，所选取的生猪屠宰场规模大小相似，屠宰量较少，因而沙门氏菌分离率高于其他地区。相同屠宰环节的分离率也高于其他地区。

从血清型统计分析结果看，分离株血清型以德尔卑沙门氏菌为主，占所检测沙门氏菌总数的39.6%，与杨宝伟等[11]的研究结果相似。鲁东部和西部地区以鼠伤寒沙门氏菌为优势血清型，东北部和西南部地区优势血清型为德尔卑沙门氏菌，而中部地区以汤卜逊沙门氏菌为主，未分离出其他血清型，与西南部地区仅分离出德尔卑沙门氏菌结果相似，分析原因可能为采集样品的屠宰场环境相似，屠宰场相对集中或者是待宰猪只来源地相同造成。而鲁西地区分离出6种血清型，分离出血清型种类最多，分析原因可能为屠宰场距离远、较分散，猪只来源地不同所引起。同时不同屠宰环节的血清型大致相同，提示本地区生猪屠宰环节存在交叉污染现象。

沙门氏菌食物中毒是全球最常见的食源性疾病之一。了解生猪屠宰环节沙门氏菌污染状况不仅能及时掌握区域内的沙门氏菌分布、血清型流行差异，而且对猪源沙门氏菌监测、对沙门氏菌在生猪屠宰环节中的流行病学调查具有十分重要的意义。本研究的初步调查研究结果也为今后生猪屠宰环节沙门氏菌污染的调查、污染状况风险评估提供基础数据。

[1]邵坤. 山东省食源性沙门氏菌监测及分型研究[D]. 济南：

山东大学，2011.

[2]王娟，郑增忍，王玉东，等. 市售禽肉产品中沙门氏菌污染状况调查[J].中国动物检疫，2010，27（7）：50.

[3]郑克新. 猪胴体沙门氏菌污染的调查[J].中国兽医杂志，2007，43（1）：51.

[4]Rahn K，Grandisd S A，Clarke R C，et a1．Amplifi cation of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specifi c method of detection of Salmonella[J]．Mol Cell Probes，1992，6 （4）：271-279．

[5]邵碧英，陈彬，汤敏英，等．沙门氏菌DNA提取及PCR反应条件的优化[J]．食品科学，2007，28（7）：331-334.

[6]食品安全国家标准. GB4789.4—2010《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》[S].北京：中国标准出版社，2010.

[7]李郁，焦新安，魏建忠，等. 屠宰生猪沙门氏菌分离株的血清型和药物感受性分析[J].中国人兽共患病学报，2008，24（1）：67-70.

[8]侯小刚，刘书亮，韩新锋，等. 四川部分地区猪肉产业链中沙门氏菌的分离及其鉴定[J].食品科学，2013，34（11）：250-253.

[9]张玮. 安徽省部分猪场生猪沙门氏菌带菌情况与耐药性研究[D].合肥：安徽农业大学，2010.

[10]张静，周源，韩玉虎，等. 屠宰场生猪主要细菌学指标的调查研究[J].畜牧与饲料科学，2011，32（5）：89-90.

[11]杨宝伟，张秀丽，曲东，等. 2007-2008陕西部分零售畜禽肉沙门氏菌血清型和基因型[J].微生物学报，2010，50（5）：654-660.

Analysis on Salmonella Contamination Status during Pig Slaughtering in Shandong Province

Liu Xianxian1，2，Wang Junwei1，Wang Juan1，Zhao Jianmei1，Gai Wenyan1，Sun Jiayi2，Zou Ming2，Huang Xiumei1，Qu Zhina1
（1.Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Animal Products of Ministry of Agriculture，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong province 266032；2.Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong province 266109）

[Objective] To investigate Salmonella contamination status of during pig slaughtering in Shandong province and understand the dynamic trend of Salmonella in pig slaughtering. [Method] 1012 samples were gathered during pig slaughtering at different level from east，north-east，middle，west and south-west of Shandong province in 2014. Salmonella strains were isolated and identifi ed by PCR and serum agglutination test and their serotypes were further analyzed with the O type serum to Salmonella. [Result] 202 Salmonella strains were isolated. The isolation rate in the east，north-east，middle，west and south-west parts of Shandong Province was 27.2%，12.6%，34.6%，12% and 13.5%，respectively. There were 9 Salmonella serotypes. S.derby，S.typhimurium and S.thompson were the dominant serotypes in this area. [Conclusion] Heavy Salmonella contaminations were observed during pig slaughtering in each slaughterhouse in Shandong province. Salmonella strains isolated had diverse phenotypes. Cross contamination of Salmonella existed in all steps of pig slaughtering.

Salmonella; pig; slaughtering; serotype; bacteria contamination

508；R387.22

B

1005-944X（2015）05-0082-05

国家农产品质量安全风险评估专项（2014）（GJFP2014007）

王君玮