大花序桉离体根培养过程中内源激素的变化

谭健晖，黄寿先

(1.广西林业科学研究院，广西 南宁 530002；2.广西大学 林学院，广西 南宁 530005)

大花序桉离体根培养过程中内源激素的变化

谭健晖1，黄寿先2

(1.广西林业科学研究院，广西 南宁 530002；2.广西大学 林学院，广西 南宁 530005)

利用大花序桉组培继代苗为材料，研究外源激素对离体根培养过程中内源激素的动态变化过程。结果表明：添加外源激素NAA和IBA，与无激素培养基间达到极显著差异；20d前后为根原基形成时期，30d前后为根原基分化增殖时期，40d前后为根原基伸长时期；不同激素对生根起重要调控作用，高IAA、ABA、iPa和低ZR含量促进根原基的形成；低IAA、ABA、iPa和高ZR含量促进根原基分化增殖；低IAA、ABA、iPa和低ZR含量促进根原基伸长。

大花序桉；组培继代苗；离体根培养；根原基；外源激素；内源激素

大花序桉Eucalyptus cloeziana属桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus。大花序桉仅天然分布于澳大利亚的昆士兰州，故此又名昆士兰桉。大花序桉先后引种于多个国家和地区，并表现出较大的生产潜力，大花序桉有别于其它桉树的一个重要特点是其木材黄褐色，结构紧密，沉重坚固，是很好的室内装饰和锯材，适合进行大径材培养[1]。由于大花序桉在我国引种少，开花结实少，且大花序桉属异花风虫媒树种，种间种内易杂交，子代分化很大，因此，无性繁殖成为大花序桉良种繁育的重要手段。大花序桉组织培养与巨桉、尾叶桉及其杂交种相比存在较大难度，难以规模化应用的主要技术瓶颈是生根困难且生根时间长[2]，因此大花序桉的组织培养多数研究仍处于实验室阶段[2-4]。笔者利用基本培养基、IAA和NAA等3因素4水平的正交试验选出大花序桉离体根培养中生根率最高的组合，并研究该培养基在根培养过程中内源激素含量的动态变化，揭示大花序桉离体根培养的内源激素机制，有效地避免大花序桉离体培养的盲目性和随意性，为大花序桉离体根培养提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择大花序桉第29代生长一致的继代苗，分别于添加外源生长素NAA、IBA和无外源生长素的培养基上进行离体根培养。离体生根培养基为1/3改良MS+NAA2.0mg/L+ IBA0.5mg/L(对照培养基为1/3改良MS)，蔗糖20g/L，7.5g/L琼脂条，调节pH值至5.6～5.8，121℃1.1kg/cm2下灭菌20min。培养温度为24℃，光照时间12h/d，光照强度1 500 lx左右。

以40d为一个培养周期，每10d进行一次取样，将试管苗从瓶内取出，剪取茎叶部分，试管苗避免沾带培养基，将实验材料装在封口袋内，标注取样时间和样品号，放在-80℃超低温冰箱中保存，待取样结束统一进行激素测定。

1.2 试验方法

1.2.1 内源激素的提取

大花序桉试管苗1.0g→加2mL样品提取液→冰浴下研磨匀浆→4℃提取4h→10 000 r/min离心15min→取上清液。上清液过80％甲醇柱→上样→收集样品→100％甲醇洗柱→100％乙醚洗柱→100％甲醇洗柱→循环。过柱后的样品，真空浓缩干燥，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液定容。

1.2.2 内源激素的测定

包被→洗板→竞争→加标样及待测样→加抗体→洗板→加二抗→洗板→加底物显色→终止反应→比色。计算公式为：

式中：B0是0 ng/mL孔的显色值；B是其它浓度的显色值。

2 结果与分析

2.1 根形态建成过程中内源激素IAA含量的变化

大花序桉根培养过程中对照和处理的IAA含量变化趋势大体相同，呈单峰变化趋势，处理和对照的IAA含量峰值分别出现在第20天和第30天(见图1)。由表1可知，培养初期对照IAA含量略高于处理，但处理IAA含量随后迅速增加，在20d时超过对照，于第30天达到峰值，然后开始下降至80 ng/g以下，对照的IAA含量在50～80 ng/g间波动，起伏不大。IAA参与根的形态建成，与根原基的形成和萌发密切相关，是大花序桉根发育的关键激素之一。高IAA含量有利于根的形成，通过添加外源生长素IBA和NAA，可以调节内源激素IAA的含量，与其它激素协同作用于大花序桉的形态建成过程，使细胞朝着有利于根的方向分化。

图1 根形态建成过程中IAA含量的变化Fig.1 IAA content changes in process of root vitro culture

表1 4种内源激素多重统计分析†Table 1 Variance analysis on different endogenous hormones

2.2 根形态建成过程中内源激素ZR含量的变化

大花序桉根培养过程中对照和处理的ZR含量呈单峰变化趋势，处理和对照的ZR含量峰值分别出现在第30和第20天(见图2)。离体培养初期，大花序桉根发育过程中ZR含量对照明显高于处理，随着培养时间的延长，处理和对照含量趋于接近。处理的ZR含量只在第30天略高于对照，从ZR的动态变化看，处理中ZR含量在10～21 ng/g间波动，变化平缓，起伏不大，而对照的ZR含量在15～55 ng/g间波动，起伏大，变化剧烈。低ZR含量有利于根的形成，通过添加外源生长素IBA和NAA，可以调节内源激素ZR的含量，使细胞朝着有利于根的方向分化。

图2 根形态建成过程中ZR含量的变化Fig.2 ZR content changes in process of root vitro culture

2.3 根形态建成过程中内源激素ABA含量的变化

大花序桉根培养过程中对照和处理的ABA含量变化大体一致，呈降低—升高—降低的单峰变化趋势(见图3)，培养初期对照的ABA含量略高于处理，之后处理的ABA含量出现明显升高，第20天时两者均出现峰值，分别为236.97 ng/g和500.26 ng/g，处理高于对照1倍以上，培养中后期ABA含量均出现下降，但处理的ABA含量一直处在较高水平。从ABA含量动态变化曲线来看，处理的ABA含量不同培养时期变化明显，而对照中的含量变化平缓，起伏不大，表明ABA是大花序桉根发育的关键激素之一，参与根的形态建成，与根原基的形成和萌发密切相关。高ABA含量有利于根的形成，通过添加外源生长素IBA和NAA，可以调节内源激素ABA的含量，与其它激素协同作用于大花序桉的形态建成过程，使细胞朝着有利于根的方向分化。

图3 根形态建成过程中ABA含量的变化Fig.3 ABA content changes in process of root vitro culture

2.4 根形态建成过程中内源激素iPa含量的变化

大花序桉根培养过程中对照和处理的iPa含量变化情况大体相反，从曲线上看，处理的变化趋势是下降—升高—下降，对照的变化趋势是升高—下降—升高—下降(见图4)。从iPa含量动态变化曲线看，在离体培养初期，处理的iPa含量下降，在第10天后开始逐渐地增加，逐渐高于对照，在第20天达到最高值，第30天含量呈现下降趋势，第40天含量低于对照，说明外源生长素的加入在前期抑制了iPa含量的增加，而在培养中期内源激素iPa含量明显上升，在培养后期iPa含量出现下降。表明iPa是大花序桉根发育的关键激素之一，高iPa有利于根的形成，通过添加外源生长素IBA和NAA，可以调节内源激素iPa的含量，与其它激素协同作用于大花序桉的形态建成过程，使细胞朝着有利于根的方向分化。

图4 根形态建成过程中iPa含量的变化Fig.4 iPa content changes in process of root vitro culture

3 讨论与结论

植物不定根的发生发展是一个极其复杂的生理生化过程。它的诱导、发生和形成与解剖学结构、内源生长素或其他促根物质、内源抑制物等多种生理生化反应相关[5-7]。植物激素是控制植物生长发育的最重要物质之一，影响植物的关键生物过程，如胚胎、根、花的发育，维管分化，顶端优势，向性反应等[8]。近年来，内源激素的研究多集中于无性繁殖方面[9-15]。传统的组织培养侧重研究不同外源激素配比对器官培养和分化的影响，但对于难生根树种而言,仅依靠外源激素的调节往往带着不同程度的盲目性，无法取得理想效果，笔者从不同离体根培养时期内源激素的动态变化角度研究外源生长素对内源激素和根形态建成的影响，以期为大花序桉根离体培养中外源激素的添加提供科学依据。

本实验在1/3改良MS+NAA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖25g+琼脂7.5g的培养条件下，添加外源激素NAA和IBA，与无激素培养基间达到极显著差异。从离体根培养的整个过程看，添加外源激素NAA和IBA，第20天内源激素IAA、ABA和iPa含量达到最高峰值，内源激素ZR出现最低峰值，且第20天时对照与处理间差异最大，说明20d前后为根原基形成时期，30d前后为根原基分化增殖时期，40d前后为根原基伸长时期。

根原基的形成、分化和增殖是离体根培养的关键时期，这一过程的不同时期有不同的激素要求，本实验中大花序桉离体根培养在根原基形成前后，内源激素IAA、ABA和iPa含量出现最高峰值，说明提高这3种激素的含量有利于根原基的形成，含量较高，对生根较有利；内源激素ZR含量则出现最低值，说明降低ZR含量有利于根原基的形成，简言之，不同激素对生根起重要调控作用，高IAA、ABA、iPa和低ZR含量促进根原基的形成；低IAA、ABA、iPa和高ZR含量促进根原基分化增殖；低IAA、ABA、iPa和低ZR含量促进根原基伸长。

[1] 广西林学会桉树专业委员会.广西桉树论文集[C].1990:272-276.

[2] 谭健晖.大花序桉离体培养及根形态建成的生理机制研究[D].南宁:广西大学,2009.

[3] 唐再生.大花序桉芽器官离体组培快繁技术研究初报[J].广西林业科学,2006,35(S1):22-23,33.

[4] 唐庆兰.大花序桉离体培养[D].南宁:广西大学.2007.

[5] Gaspar T,Penel C,Thorpe J,et al.Peroxidase 1970-1980.Asurvey of their biochemical and physiological roles in higher plants[M].Geneve:Universite of Geneve,1982:25-32.

[6] Bouillenne R,Bouillenne-Walrand M.Auxines etbouturages [C]//Proc 14 Int Hort Cong.[S.l.]:[s.n.],1955:231-238.

[7] Bassuk N L,Hunter L D,Howard B H.The apparent of polyphenol oxidase and phlorizin in the production of apple rooting factors[J].J.Hort.Sci.,1981,56(4):3-13.

[8] 葛 辛.高级植物分子生物学[M].北京:科学出版社,2004:123-145.

[9] 韩碧文,李颖章.植物组织培养中器官建成的生理生化基础[J].植物学通报,1993,10(2):1-6.

[10] 刘华英,萧浪涛,何长征.植物体细胞胚发生与内源激素的关系研究进展[J].湖南农业大学学报,2002,28(4):349-354.

[11] Jimenez V M,Bangerth F.Endogenous hormone levels in explants and in embryogenic and non-embryogenic cultures of carror[J].Physiol.Plant,2001,111(3):389-395.

[12] 刘 涛,张华新,庞晓慧.翅果油树年龄与内源激素含量及嫩枝扦插生根率的关系[J].经济林研究,2009,27(4):26-30.

[13] 董胜君,刘明国,戴 菲,等.山杏嫩枝扦插生根过程中插穗内源激素含量的变化[J].经济林研究,2013,31(4):108-114.

[14] 陈博雯,刘海龙,蔡 玲,等.干旱胁迫对油茶组培苗与实生苗内源激素含量的影响[J].经济林研究,2013,31(2):60-64.

[15] 马振华,王吉斌,李才文,等.四倍体刺槐硬枝扦插生根过程中内源激素的变化[J].中南林业科技大学学报,2013,33(6):26-32.

Change of endogenous hormones in process of root in-vitro culture of Eucalyptus cloeziana

TAN Jian-hui1,HUANG Shou-xian2
(1.Guangxi Forestry Research Institute,Nanning 530002,Guangxi ,China; 2.College of Forestry,Guangxi University,Nanning 530005,Guangxi,China)

By taking Eucalyptus cloeziana tissue culture subculture seedlings as the tested materials,the dynamic effecting processes of exogenous hormone on endogenous hormones in the process of in-vitro root culture of the seedlings were investigated.The results indicate that the seedlings of adding exogenous hormones of NAA and IBA to the culture medium had significant differences with hormone-free medium seedling; Twenty days time was the root primordia formation period,thirty-days time was the differentiation and proliferation period,forty-days time was the elongation period of adventitious root primodium; The every kinds of hormones played important regulatory roles for the seedlings rooting; High endogenous of IAA,ABA,iPa and low levels of ZR promoted the formation of primordial rooting; Low endogenous of IAA,ABA,iPa and high levels of ZR promoted the differentiation and proliferation of primordial rooting; Low endogenous of IAA,ABA,iPa and low levels of ZR promoted the elongation of adventitious root primordium.

Eucalyptus cloeziana; tissue culture subculture seedlings; in-vitro root culture; root primordium；exogenous hormone;endogenous hormones

S722.3+7；S792.39

A

1673-923X(2015)01-0034-03

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.01.007

2013-10-08

广西自然基金项目(2011GXNSFA018095)

谭健晖，教授级高工；E-mail：tanjianhui94@126.com

谭健晖，黄寿先.大花序桉离体根培养过程中内源激素变化[J].中南林业科技大学学报，2015,35(1):34-36,55.

[本文编校：谢荣秀]