不同二次蒸馏方式对浓香型白酒中氨基甲酸乙酯去除率的影响*

吴晨岑，范文来，徐岩

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡，214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)是一种广泛存在于酒精饮料中的致癌物，被国际癌症研究机构(IARC)归类为2A类致癌物［1］。加拿大与巴西蒸馏酒中 EC 限量标准均为 150 μg/L［2-3］，我国尚未制定蒸馏酒中EC的限量标准。

酒精饮料中EC的产生途径主要有两种:一是氰化物途径，氰化物被氧化为氰酸盐后与乙醇反应形成EC［4-5］;二是尿素途径，尿素在酸性条件下直接与乙醇反应生成 EC［2，6］，或尿素热分解产生的异氰酸和氰酸盐与乙醇反应形成EC［7］。针对这些产生机理，国外开发了众多降低酒精饮料中EC的方法，主要有:(1)原料预处理:如去除富含氰化物的果核［8］;(2)工艺控制:如烈酒避光贮存并缩短贮存时间［9］;控制发酵和贮存温度［10］;分离酒尾并不再重蒸酒尾［11］;采用低温和高回流率的蒸馏方法［2］;添加酸性脲酶以降低尿素含量［12］等;(3)改良微生物菌种:如选育低产尿素酵母，对酿酒酵母的基因进行改造以降低其精氨酸酶活性，阻断精氨酸代谢生成尿素途径［13］;(4)高EC含量原酒处理方法:阴离子交换柱吸附EC前体物质［14］;添加焦亚硫酸钾作为一种抗氧化剂降低EC含量［15］等。世界各国蒸馏酒的生产大多采用液态壶式蒸馏，蒸馏二次或二次以上［16-18］;二次蒸馏能有效降低威士忌和甘蔗朗姆酒(cachaca)中 EC 的含量［6-17，19］。

我国白酒中EC的研究起步较晚，多集中在检测方面［20-22］，而在白酒生产过程中如何降低EC含量的研究仍然处于空白。我国白酒因其固态发酵模式多采用甑桶蒸馏方式［23-24］，通常不进行二次蒸馏。近期研究表明，浓香型原酒经过壶式、常压或减压蒸馏后，感官品质有所提升，原酒中的异嗅减轻，总酸浓度大幅度下降，总酯浓度下降差异较大，而酒体仍不失浓香型酒的主体风格［25］。

本研究以浓香型新产原酒为研究对象，采用壶式、常压及减压蒸馏对浓香型原酒进行二次蒸馏，研究了不同二次蒸馏方式、不同起始EC浓度等对EC去除率的影响，以及EC、氰化物和尿素在壶式蒸馏过程中的馏出规律，为白酒中EC含量的控制提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

浓香型原酒，由国内某酒厂提供，2014年产，酒精度72.7%vol;氨基甲酸乙酯(EC，纯度 ＞99%)、13C-尿素(99%，内标)、N-叔丁基二甲基甲硅烷-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA，纯度≥95%)、丁二酰亚胺、N-氯代丁二酰亚胺、吡啶、巴比妥酸、尿素、乙腈、二氯甲烷，色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司;氨基甲酸乙酯-d5(EC-d5，98%，内标)、无水乙醇，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司;NaCl、KCN，分析纯，上海国药集团。

铜制壶式蒸馏器7.5 L，葡萄牙Iberian Coppers S.A.;电子万用炉220 V/2 kW，楚水电热电器厂;旋转蒸发仪，上海安谱实验科技股份有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，孔义市予华仪器有限责任公司;Milli-Q超纯水系统，美国 Millipore公司;GC 6890N-MSD 5975，美国Agilent公司;DB-FFAP色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，上海安谱实验科技股份有限公司;赛默飞TSQ 8000 Evo三重四极杆气质联用仪，TG-5MS 色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司;85 μm固相微萃取头PA，美国Sigma-Aldrich公司;UV-2802紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;DK-S24电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司;电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 二次蒸馏方式

壶式蒸馏:参照文献方法［25］，4.5 L低度酒(原酒加超纯水稀释至酒精度为28%vol或直接使用10～40%vol的初次蒸馏酒)装入7.5 L铜壶，连接好鹅颈管和冷凝器。常温自来水冷凝，电子万用炉加热，采用二种蒸馏方式即慢火蒸馏(电炉调至500 W)和快火蒸馏(电炉调至1 500 W)。初馏液(初始低度酒体积的1.5%［19，26］)作为酒头，酒头之后到馏分酒精度为60%vol作为酒身，酒身之后到馏分酒精度为0%vol作为酒尾。关闭电炉，收集铜壶中的残液。酒头与酒尾可参与下一批二次蒸馏。酒身即为壶式蒸馏酒。

常压蒸馏:参照文献方法［25］，将300 mL低度酒倒入1 L烧瓶中，加入几颗玻璃珠，连接好蛇形冷凝管与接收瓶。电子万用炉加热，常温自来水冷凝。酒头、酒身和酒尾的掐取比例同壶式蒸馏，关闭电炉，收集烧瓶中残液。酒身即为常压蒸馏酒。

减压蒸馏:参照文献方法［25］，300 mL低度酒倒入1 L旋蒸瓶中。旋蒸加热温度40℃，真空表读数-0.1MPa，常温自来水冷凝。酒头、酒身和酒尾的掐取比例同壶式蒸馏，关闭旋蒸仪，收集旋蒸瓶中的残液。酒身即为减压蒸馏酒。

1.2.2 顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)联用技术定量EC

参照文献方法［20］，取20 mL酒样，40℃旋转蒸发至10 mL，用超纯水水洗旋蒸瓶3次定容至原体积(20 mL)，取8 mL置于20 mL顶空瓶中，加3 g NaCl饱和，添加8 μL 内标 EC-d5(200 μg/L，最终浓度)，进行HS-SPME。萃取条件:PA萃取头，萃取温度70℃，萃取时间45 min，250℃下解吸5 min。

GC条件:进样口温度250℃，载气 He，流速1 mL/min，不分流进样，色谱柱为DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm，J＆W Scientific)。升温程序:50 ℃保持2 min，以5℃/min的速度升温至170℃，再以10℃/min的速度升温至230℃，保持5 min。

MS条件:EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度为230℃，扫描范围35～350 amu。采用选择离子监测(selected ion monitoring，SIM)模式，特征离子m/z 62、64分别用于EC和EC-d5定量。采用NIST05.L库进行质谱分析。每个酒样重复测定3次。

标准曲线:以60%vol的酒精水溶液配制具有一定浓度梯度的EC标准液，按照与酒样相同的处理方法进GC-MS分析。以EC和EC-d5的峰面积之比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.3 吡啶-巴比妥酸比色法定量氰化物

参照文献方法［27］，配制氧化剂(N-氯代丁二酰亚胺-丁二酰亚胺):1 g丁二酰亚胺溶于30 mL超纯水中，再加入0.1 g N-氯代丁二酰亚胺并搅拌至溶解，加超纯水定容至100 mL，4℃避光贮存;配制显色剂(巴比妥酸-吡啶):将6 g巴比妥酸溶于少量水中，并加入30 mL吡啶，加超纯水定容至100 mL，4℃避光贮存。

酒样预处理:酒精度38%vol以上的酒样加超纯水或乙醇稀释至46%vol，酒精度15% ～37%vol的酒样加超纯水或乙醇稀释至30%vol，酒精度低于15%vol的酒样不稀释。取20 mL预处理后的酒样，加入1 mL氧化剂和1 mL显色剂，25℃下反应25 min，于575 nm处测定吸光度。

标准曲线:分别以0、30%、46%vol的酒精水溶液配制具有一定浓度梯度的KCN标准液，按照与酒样相同的处理方法进行氰化物的测定。以吸光度为横坐标，KCN浓度为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.4 衍生化结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)定量尿素

参照文献方法［28］，取 100 μL 酒样和 100 μL 内标13C-尿素标准品溶液，置于2 mL样品瓶中氮吹吹干，加入50 μL二氯甲烷再次吹干，加50 μL MTBST-FA衍生剂和50 μL乙腈100℃反应60 min后，进样检测。

GC条件:进样口温度250℃，载气 He，流速1 mL/min，进样量1 μL，不分流进样，色谱柱为TG-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm，Thermo Scientific)。升温程序:50℃保持1 min，以20℃/min的速度升温至170℃，保持5 min;以4℃/min的速度升温至200℃，保持3 min;再以4℃/min的速度升温至280℃，保持10 min。

MS条件:EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度300℃，扫描范围40～300 amu，离子传输线温度280℃。采用选择反应监测(selected reaction monitoring)模式，特征离子对m/z 231-147和m/z 232-147分别用于尿素和内标13C-尿素两种物质的定量。使用Nist 2011进行质谱分析。

标准曲线:配制具有一定浓度梯度的尿素标准液，按照与酒样相同的处理方法进行尿素的测定。以尿素和C13-尿素的峰面积比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标，建立标准曲线。

1.2.5 EC去除率计算公式

式中:R1，EC绝对去除率，%;R2，EC 相对去除率，%;m0，原酒 EC质量，μg;m1，二次蒸馏酒头 EC质量，μg;m2，二次蒸馏酒身 EC 质量，μg;m3，二次蒸馏酒尾EC质量，μg;m4，二次蒸馏残液 EC质量，μg;mc，二次蒸馏酒头、酒身、酒尾及残液中EC质量之和，μg。其中 m0＜mc。

2 结果与讨论

2.1 白酒中EC的定量

改进史斌斌等［20］建立的测定方法，采用同位素氘标记的EC-d5而非氨基甲酸丙酯作为内标，特征离子m/z 62、64分别用于EC和EC-d5的定量。该方法消除了氨基甲酸丙酯出峰处可能存在的干扰峰。由表1可知，该方法对目标物质具有较宽的线性范围，线性关系良好(R2＞0.99)，检测限(limit of detection，LOD)较低，能够满足白酒中EC定量分析的要求，向白酒样品中添加相近浓度的EC标准品，测得回收率在90% ～105%，相对标准偏差在2.31% ～8.79%，该方法表现出良好的准确性与精确性。

表1 白酒中EC定量方法的线性、检测限、回收率及精密度(n=3)Table 1 Linearity，LOQ，recovery，and precision of the quantification of EC in Chinese liquor(n=3)

2.2 EC去除率

二次蒸馏是最常用的去除蒸馏酒中EC含量的方法［26］。本研究中的EC去除率有两种定义:二次蒸馏后的酒相对于蒸馏前原酒中EC含量的降低百分比，即EC绝对去除率(R1);而参照甘蔗朗姆酒(cachaca)［19］和威士忌［6］的二次蒸馏时的EC降低百分比，即EC相对去除率(R2)。由于蒸馏过程的高温［2］与铜的存在［6］促进了EC的形成，二次蒸馏后酒头、酒身、酒尾和残液的EC总质量较蒸馏前原酒上升了27.24% ～229.98%(表2)，所以每一种蒸馏方式的R1均低于R2。

表2 不同二次蒸馏方式对EC去除率的影响(n=3)Table 2 Influence of different types of double distillation in EC removal efficiency(n=3)

续表2

2.3 不同二次蒸馏方式对EC去除率的影响

本研究中测定的浓香型原酒中EC浓度为(233.33±7.21)μg/L，二次蒸馏后的酒中EC浓度下降至(43.57～94.77)μg/L，EC绝对去除率(R1)为71.07% ～86.70%，EC相对去除率(R2)高达81.46% ～92.76%(表2)。

快、慢火壶式蒸馏的R2均在90%以上，接近于甘蔗郎姆酒(cachaca)［19］二次蒸馏的EC去除率97%和威士忌［6］二次蒸馏的EC去除率98% ～99%。慢火壶式蒸馏总耗时(206 min)是快火(75 min)的2.7倍，慢火的R2(90.86%)稍低于快火(92.76%)，但从酒身EC浓度来看，慢火(75.23 μg/L)略低于快火(78.30 μg/L)，因此慢火的R1(77.05%)略高于快火(76.11%);而从EC增加百分比来看，快火(229.98%)明显高于慢火(151.21%)，可能是因为快火的高温促使形成了更多的EC，从而累积在酒尾及残液中［2，19］。总体来讲，快、慢火二次蒸馏对于白酒中EC的去除差异不大;而Almeida等［29］的研究表明快火二次蒸馏(55 min)的甘蔗朗姆酒中EC含量为39.2 μg/L，是慢火二次蒸馏(100 min)的1.84倍，其蒸馏采用燃烧甘蔗渣的直火式蒸馏，有别于本研究中采用的电炉加热方式。

减压蒸馏时的旋蒸加热温度控制在40℃，高沸点的EC很难被蒸出，减压蒸馏能获得EC浓度最低(43.57 μg/L)的二次蒸馏酒，R1为86.70%，高于其余任意一种二次蒸馏方式，EC增加百分比最低(27.24%);R2为89.55%，稍低于壶式蒸馏。然而近期研究表明，相对于壶式蒸馏和常压蒸馏，减压蒸馏的总酸、总酯含量降幅最大，分别下降90.20%、30.45%［25］。

常压蒸馏的 EC去除率最低(R1，71.07%;R2，81.46%)，但从 EC增加百分比来看，常压蒸馏(56.06%)明显低于壶式蒸馏，推测壶式蒸馏时铜的存在对EC的形成有一定影响［4］。

2.4 不同起始EC浓度原酒对EC去除率的影响

向1 731.2 mL浓香型原酒(EC浓度，233.33±7.21 μg/L)中分别添加 31、82 μL 的 EC 标准溶液(浓度20 316 mg/L)配制成EC浓度为597.12 μg/L和1 195.62 μg/L的原酒(表3)，对中、高EC浓度原酒进行快火壶式蒸馏。结合表3中的未添加EC标准品的快火壶式蒸馏(对照组)，从酒身来看，不同起始EC浓度浓香型原酒经壶式蒸馏后的酒身中EC浓度并非一致，其浓度范围在78.30～219.91 μg/L;而从EC去除率来看，3种EC浓度原酒的R1在76.11%～87.64%，R2在89.91% ～92.76%，高沸点的EC主要集中在酒尾及残液中。所以，壶式蒸馏能有效去除原酒中EC的含量，对不同EC浓度的原酒均能达到较好的EC去除效果。

表3 不同起始EC浓度浓香型原酒对EC去除率的影响(n=3)Table 3 Influence of different concentration of EC in strong aroma type base liquor in EC removal efficiency(n=3)

2.5 浓香型原酒壶式蒸馏过程中EC、尿素和氰化物的变化

快火壶式蒸馏时，随着酒精度的下降，EC浓度呈现先下降后平稳再上升的趋势(图1)。这与甘蔗郎姆酒(cachaca)［19］和威士忌［6］二次蒸馏过程中 EC 的馏出规律类似。

图1 浓香型原酒快火壶式蒸馏过程中酒精度、EC、氰化物和尿素的变化Fig.1 Ethanol，EC，cyanide，and urea concentrations during fast pot still distillation of strong aroma type liquor

蒸馏过程中，酒可以看作是酒精与水的共沸混合物，其沸点低于100℃，低于EC的沸点186℃，但并不能阻止EC被蒸馏到酒中［30］，整个蒸馏过程中均能检测到EC。EC在乙醇中的溶解度(1.2 g/mL)高于水中的溶解度(0.1 g/mL)［31］，并且5 min前的初馏分中含有大量氰化物(1 375.20 μg/L)，可能与乙醇反应形成EC［3］，因而初馏分中有较高含量的 EC(251.67 μg/L)，二次蒸馏有必要掐去酒头。

在蒸馏的5～20 min内，馏分酒的酒精度由74.1%vol下降至70.7%vol，蒸气温度从65℃上升至84.5℃，馏分酒中EC含量呈明显的下降趋势，在第25 min尿素含量出现峰值(289.47 μg/L)，而 EC浓度仍维持在较低水平。推测在蒸馏过程前期，EC主要来源于酒中本身存在的EC。

当馏分酒精度达到61.3%vol时，酒身接取完毕，酒尾开始蒸出，馏分酒中EC含量迅速增加，氰化物含量不断下降，而尿素含量先下降后至40 min开始与EC同步波动增长。随着蒸馏过程的进行，共沸混合物因酒精浓度下降而沸点逐渐升高，蒸气温度从88℃不断上升至99℃，推测因高温酒中微克/升级的尿素和氰化物会加速与乙醇的反应，生成更多的EC［2］，从蒸馏后期氰化物下降与尿素上升的变化趋势来看，氰化物可能是蒸馏后期形成EC的主要前体。当馏分酒精度降至0%vol时，酒尾接取完毕，蒸馏过程结束，最终馏分的EC浓度达到整个蒸馏过程的最高值258.89 μg/L。可见EC大量存在于61.3%vol以下的酒尾中，二次蒸馏的掐头去尾工艺能有效降低白酒中EC的含量。

3 结论

采用壶式、常压及减压蒸馏对降度的浓香型原酒进行二次蒸馏，研究不同二次蒸馏方式对EC去除率的影响，发现壶式蒸馏时的 EC相对去除率最高(92.76%)，其次是减压蒸馏、常压蒸馏。采用适当的掐头去尾方法能够获得EC浓度(43.57～113.04 μg/L)较原酒(233.33 μg/L)低得多的二次蒸馏酒。EC大量富集在酒尾及残液中。慢火壶式蒸馏酒的EC浓度略低于快火壶式蒸馏，快、慢火壶式蒸馏对EC的去除无明显差异。二次蒸馏对不同EC浓度(233.33～1 162.94 μg/L)的原酒均能达到较佳的EC去除效果，绝对去除率为76.11% ～87.64%，EC相对去除率在89.91%～92.76%。减压蒸馏能获得最低EC浓度的二次蒸馏酒，这将在以后进一步研究。壶式蒸馏过程中EC浓度随着酒精度的降低而呈现先下降后平稳再上升的趋势，二次蒸馏掐头去尾工艺能有效降低白酒中EC的含量，蒸馏过程前期的EC主要来源于酒中本来存在的EC，而蒸馏过程后期的EC可能主要来自于氰化物等前体物质的转化，后续将做进一步的深入研究。

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