泸型大曲冬夏两季培菌期微生态的比较研究

姚霞，明红梅，*，周健，许德富，王小军，朱莉莉，陈晓旭

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000）

泸型大曲冬夏两季培菌期微生态的比较研究

姚霞1，明红梅1，*，周健1，许德富2，王小军2，朱莉莉1，陈晓旭1

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000）

大曲的质量与大曲微生态的微生物种类、数量及理化指标等相关。通过对泸型大曲冬夏两季培菌期大曲微生态指标跟踪检测，并将冬夏两季培菌期大曲微生态指标进行比较，结果表明：冬季大曲品温比夏季低，水分散失比夏季慢；冬季大曲总体微生物数量比夏季多，微生物的种类与夏季相当；冬季大曲氨态氮含量和糖化力均比夏季高，但酯化力比夏季低。

泸型大曲；培菌期；微生态

大曲在白酒酿造中是一种糖化发酵剂[1]，其主要作用是在酿酒过程中把原料中的淀粉或其他糖分转变成葡萄糖再生成酒。除此以外，还具有提供菌源、糖化发酵、投粮和生香等作用[1]。用大曲酿酒是我国独特的酿酒工艺，大曲酿酒的基础是大曲中的微生物[2]。大曲为微生物的生长繁殖提供了各种营养物质和适宜的环境条件，同时，这些丰富的微生物类群在大曲中生长和代谢，形成了白酒酿造过程中所需要的各种酶及丰富的代谢产物，使大曲具有糖化力、发酵力、酯化力和蛋白质分解能力等多种功能[3]，其代谢产物也是白酒中的香味物质或香味前体物质，进而影响白酒品质[4]。

大型酒厂一般拥有自己的制曲车间，不仅供本厂使用，同时也作为商品，对外销售。生产优质大曲是酿酒产业和酿酒人的共同愿望。大曲质量的好坏与大曲微生态密切相关，受季节、地域、温度、环境微生物区系等多种因素的影响，大曲微生态呈现不同的差异，进而导致大曲质量参差不齐。而大曲微生态变化最显著的时期为大曲的培菌期。因此，本研究主要针对冬夏两季培菌期泸型大曲的微生态指标（微生物种类、数量及理化指标等）进行对比研究，以期为改进制曲工艺，进一步提高浓香型大曲的质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究的样品为冬季1月和夏季8月培菌期的中高温大曲曲样，由泸州老窖制曲厂提供。

1.2 曲样

大曲安曲完成以后开始取样，取样时间点分别为第0、1、3、5、7、10天，每次取底楼库房不同的五点处的大曲，然后粉碎混合均匀取200 g。

1.3 培养基

霉菌采用虎红琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母菌采用马铃薯葡萄糖培养基[5]，细菌和芽孢杆菌采用营养琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.4 大曲微生物分离计数

1.4.1 大曲菌悬液制备

将大曲粉碎混合均匀在无菌环境中称取1g曲样，放入装有99mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，在摇床上振荡30min，充分打散混匀菌悬液，并制成10-2菌悬液，静置澄清，取上清液做10倍逐级稀释至适当倍数[6]。

1.4.2 芽孢细菌计数

同上，无菌称取1 g曲样装有99mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30min，取上层菌悬液，在80℃水浴中处理10min，杀死非芽孢菌。然后进行稀释，取10-2、10-3、10-4稀释度菌悬液进行平板涂布，37℃倒置培养1 d～2 d，平板计数[7]，并结合镜检。

1.4.3 细菌、霉菌和酵母菌的计数

细菌、霉菌、酵母菌的菌悬液制备方法同芽孢菌，制好菌悬液后梯度稀释，取10-3和10-4和10-5进行平板涂布，细菌在37℃培养箱中倒置培养1 d～2 d，霉菌和酵母菌在28℃培养箱中倒置培养2 d～3 d，然后进行平板计数[7]。

1.5 理化指标的测定

1.5.1 品温测定

取样时将水银温度计插入大曲曲心中，待温度平衡时读取温度，即为大曲品温，每次选取库房3个不同坯层大曲测量品温，最后求均值。

1.5.2 检测分析

部分大曲理化指标：水分测定、酸度、糖化力、酯化力和氨态氮的测定参照文献[1，8-9]进行。

2 结果与分析

2.1 大曲品温及水分变化趋势

在大曲培菌期，微生物的大量生长繁殖消耗了大曲中的营养物质、空气中的氧，产生大量的生物热，使大曲的品温逐渐升高，大曲内部逐渐形成微氧环境。在高温和微氧的作用下，部分不耐热菌和好氧菌的生长受到抑制或停止，大曲品温开始降低。水分含量随着大曲品温的升高快速的蒸发，大曲的水分含量一直呈下降的趋势。

在培菌期，不同季节大曲品温变化趋势见图1，不同季节大曲含水量变化趋势见图2。

图1 冬夏两季培菌期大曲品温变化趋势统计结果Fig.1 The Daqu temperature change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

图2 冬夏两季培菌期大曲含水量变化趋势统计结果Fig.2 The Daqu moisture content change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

由图1可以看出，冬季大曲品温整体变化趋势是逐渐升高，培菌后期降低。但安曲时大曲品温稍高于第1天的大曲品温，可能是机械加工大曲产生了摩擦热所致。在第7天左右品温达到最高，升到60℃左右。夏季大曲品温整体变化趋势也是先升高后降低。在第7天左右品温达到最高，升到65℃左右。总体来看，夏季大曲品温要高于冬季。

由图2可以看出，无论冬季还是夏季，大曲水分含量均逐渐降低，夏季大曲水分散失速率比冬季快。夏季大曲含水量在第10天最低，达到16%左右，冬季大曲含水量在第10天最低，达到23%左右。

2.2 培菌期微生物统计结果

2.2.1 冬夏两季培菌期细菌和芽孢细菌的变化趋势

在培菌期中，不同季节细菌的变化趋势见图3，不同季节的芽孢细菌变化趋势见图4。

图3 冬夏两季培菌期大曲细菌变化趋势统计结果Fig.3 TheDaqu bacteria change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

图4 冬夏两季培菌期大曲芽孢菌变化趋势统计结果Fig.4 The Daqu spore bacteria change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

由图3可知，在培菌安曲时（即0时）冬季的细菌数量没有夏季的多，随着时间的延长冬季大曲细菌数在培菌期逐渐增多，而夏季细菌数在培菌初期逐渐升高，在第6天左右达到最高，随后降低，到培菌末期稍有回升。这是因为大曲的微生物是由粮食自身携带的微生物和空气中的微生物自然接种而来[1]，故冬季大曲培菌安曲时检测的细菌数不及夏季的高。随着培菌时间延长大曲品温逐渐升高，这给细菌生长繁殖提供适宜的温度条件，故在培菌初期（0～3 d）无论冬季还是夏季细菌不断繁殖，数量不断增加。

在培菌中期（3 d～7 d），随着时间的延长，品温升高较快，冬季培菌在第6天品温达到50℃左右，在第7天品温达到60℃左右，这已经超过了一般细菌的最适生长温度，部分不耐热细菌被杀死，小部分耐热细菌得以存活，一部分细菌以芽孢的形式度过高温期，如图4所示，这与部分耐热芽孢菌继续生长繁殖有关[10]，所以冬季培菌期中期细菌数量呈缓慢增长趋势；夏季培菌在第5天品温达到60℃左右，第7天品温达到65℃，这已经远远超过一般细菌的最适生长温度，大部分不耐热细菌被杀死，部分芽孢菌也被杀死。可能少数嗜热芽孢菌仍能生长繁殖，如图4所示的芽孢菌变化趋势，所以，夏季培菌中期细菌数量呈先下降后上升趋势。

在培菌末期（7 d～10 d），无论冬季还是夏季，品温下降，环境中微生物和部分耐热细菌继续繁殖，部分芽孢菌复苏繁殖，如图3、图4所示，细菌和芽孢菌都呈增长趋势。

2.2.2 冬夏两季培菌期霉菌、酵母菌的变化趋势

在培菌期，不同季节的霉菌的变化趋势见图5，不同季节酵母菌变化趋势见图6。

由图5可知，在安曲时冬季的霉菌数量比夏季的低，冬夏两季菌体数量变化趋势都是先增加后降低。冬季霉菌的总体数量要稍多于夏季。

图5 冬夏两季培菌期大曲霉菌变化趋势统计结果Fig.5 The Daqu mycetes change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

图6 冬夏两季培菌期大曲酵母菌变化趋势统计结果Fig.6 The Daqu saccharomycetes change trend statistical results during bacteria culture period of winter and summer

培菌前期，冬夏两季大曲霉菌数量急剧增加，夏季增长速度比冬季的快。培菌中期，冬季和夏季大曲霉菌数量开始减少，冬季品温最高达到60℃左右，夏季品温达到65℃，受大曲品温的影响[11]，高温抑制霉菌生长繁殖，同时大曲水分散失，不利于霉菌的生长，大部分霉菌死亡。在培菌末期，冬季大曲霉菌数量有所回升，而夏季霉菌数量一直下降，这是因为在培菌末期，冬季大曲品温在40℃左右，水分含量在23%左右，一部分存活的霉菌孢子能够再次生长繁殖；夏季的大曲温度还在55℃以上，水分含量在16%左右，不利于霉菌孢子的生长繁殖。

由图5、图6对比可知，冬夏两季培菌期酵母菌的数量变化趋势和霉菌数量的变化趋势接近。一方面，酵母菌和霉菌相似，也受到大曲品温和含水量影响[12]；另一方面，由于酵母菌的生长繁殖有赖于霉菌[13]，霉菌在生长繁殖过程可以产生大量的淀粉酶，将淀粉水解为葡萄糖，为酵母菌生长繁殖提供能源物质，因此，酵母菌数量一定程度上受到霉菌数量的影响。

2.3 培菌期部分理化指标测定结果

在培菌期，冬季理化指标测定结果见图7，夏季理化指标测定结果见图8。

图7 冬季理化指标测定结果Fig.7 Physical and chemical index determination results in winter

图8 夏季理化指标测定结果Fig.8 Physical and chemical index determination results in summer

从图7、图8变化趋势来看：在培菌期冬季和夏季的理化指标变化趋势总体一致。酯化力和氨态氮是呈现逐渐上升的整体趋势，酸度的变化趋势接近，糖化力呈先降后升的变化趋势。

这些变化都与微生物生长繁殖代谢息息相关。在整个培菌期，一直有微生物进行生长繁殖，随着发酵的进行，大量的营养物质被消耗，产生、积累一些代谢产物和各种酶类，如淀粉酶，蛋白酶，酯化酶等。因此，从总体的趋势来看，酯化力、氨态氮含量和糖化力呈现上升的趋势，同时中间会有波动现象，这是因为随着发酵的进行，不同的时期的优势菌群不一样，如发酵前期细菌、酵母占据优势，随后大曲酸度升高，霉菌开始大量增殖，当大曲达到顶温时，由于高温微氧的筛选作用，这时候耐热微生物开始占据优势，而不同时期的优势菌群所产酶类和代谢产物有较大的差别，这就导致在各种酶类积累的过程中，虽然整体呈现上升的趋势，但是有一定的波动性。

从图7、图8理化指标测定结果来看：在培菌末期，夏季的酯化力是冬季的1.6倍左右，而冬季氨态氮含量是夏季的1.25倍左右，酸度在冬夏两季差别不明显。冬季和夏季糖化力在最开始都很高，后来降低，培菌末期又快速增长，最终检测的糖化力冬季是夏季的2.4倍左右。原因分析主要有3个方面：第一，大曲品温和含水量影响微生物的生长繁殖，微生物菌群菌系消长[14]过程又影响大曲理化指标变化。夏季大曲最高品温高于冬季，水分散失多于冬季，冬季总体微生物数量多于夏季，特别是与蛋白酶分泌有关的细菌、霉菌数量均高于夏季，这就导致冬季大曲的氨态氮[15]含量要高于夏季；第二，霉菌是大曲糖化力的主要动力来源[2]，冬季温度和湿度条件适宜霉菌生长繁殖，因此，冬季大曲霉菌数量比夏季的多，同时酶的活力和温度有关，温度高酶易失活，这就导致冬季大曲的糖化力比夏季的高；第三，夏季大曲品温比冬季的高，在高温的筛选作用下，夏季大曲芽孢菌数量较多，而芽孢菌是代谢产生酯化酶的功能菌之一[2]，因此，在培菌末期，夏季大曲的酯化力比冬季的高，可能与芽孢菌的数量丰富有关，但还需要进一步研究。

3 结论

本研究利用微生物可培养技术跟踪分析培菌期大曲中各类微生物，结果发现，细菌和霉菌在大曲微生物类群中占优势，而酵母菌数量相对较少。

大曲的理化指标和微生物类群、数量在一定程度上反映了大曲的品质，优质曲的微生物数量和种类比普通曲丰富，酯化力、糖化力、氨态氮含量也高于普通曲[3]。本研究结果表明，冬夏两季培菌期大曲微生态存在一定的差异：培菌期冬季的微生物总数量要多于夏季；夏季的酯化力高于冬季；冬季的糖化力和氨态氮含量要高于夏季。培菌期大曲微生态差异的原因主要受季节温度的影响。大曲的微生态随着转化发酵期和后期的贮存，还在进一步发生变化，有待后续研究。

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Comparative Research of the Microbial Ecology in the Luzhou Daqu during Cultivation in Winter and Summer

YAO Xia1，MING Hong-mei1，*，ZHOU Jian1，XU De-fu2，WANG Xiao-jun2，ZHU Li-li1，CHEN Xiao-xu1
（1.Sichuan University of Science&Engineering of Bioengineering Institute，Zigong643000，Sichuan，China；2.Luzhou LaoJiao ComPany，Luzhou 646000，Sichuan，China）

The quality evaluation of daqu is related to many factors，such as the species and numbers of the microorganisms，the physical-chemical indexes，etc.By tracking and detection of the Micro ecological indicators in winter and summer about Luzhou laojiao Daqu which is during the bacteria culture period.At the same time，the microecological index of the winter and the summer are compared，the results shoed that：the product temperature in winter was lower than in summer，the rate of moisture loss in winter was slower than in summer，too；The microbe quantity of Daqu in winter was more than summer's，the microbial species in winter and summer are equally.The ammonia nitrogen content and the saccharifying power of Daqu in winter is higher than in summer，but the esterifying power of Daqu in winter was lower than in summer.

Daqu of Lu type；bacteria culture period；microecological

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.034

2014-09-27

泸州市科技局应用基础项目（2011-S-28）；泸州老窖科研奖学金项目（13ljzk04）；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室项目（NJ2011-13）；四川省高等教育质量工程项目（2011-659）

姚霞（1988—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：酿酒微生物研究及应用。

*通信作者：明红梅（1971—），女（汉），副教授，从事酿酒微生物研究。