铁皮石斛多糖对MPP+诱导的PC12细胞损伤的抑制作用

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(1.南华大学附属第一医院神经内科，湖南 衡阳 421001；2.桂林医学院附属医院核医学科；3.衡阳市中心医院急诊科；4.南华大学附属第二医院泌尿外科)

·基础医学·

铁皮石斛多糖对MPP+诱导的PC12细胞损伤的抑制作用

董昕1，廖慧颖1，陆素青2，李国术3，符婉1，潘思1，张涛4*

(1.南华大学附属第一医院神经内科，湖南 衡阳 421001；2.桂林医学院附属医院核医学科；3.衡阳市中心医院急诊科；4.南华大学附属第二医院泌尿外科)

目的观察铁皮石斛多糖对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)所致PC12细胞损伤的抑制作用及可能机制。方法实验分为对照组、MPP+损伤模型组、铁皮石斛多糖组(50、100、200和400 μg/mL)。MPP+损伤模型组细胞用含10 μmol/L MPP+的培养基处理细胞24 h；铁皮石斛多糖组细胞用含50、100、200和400 μg/mL铁皮石斛多糖的培养基预处理2 h后，再加入MPP+(10 μmol/L)处理细胞24 h；对照组细胞给予等量生理盐水处理。MTT比色法检测细胞存活率，检测细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果与对照组比较，MPP+处理显著降低了PC12细胞的存活率，显著升高了细胞培养液中LDH的水平和细胞中MDA的含量，显著降低了细胞中SOD的活性(均P<0.05)；与损伤模型组比较，200和400 μg/mL铁皮石斛多糖组PC12细胞的存活率显著升高，细胞培养液中LDH的活性和细胞中MDA的含量显著升高，细胞中SOD的活性显著降低(均P<0.05)。结论铁皮石斛多糖抑制了MPP+诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与铁皮石斛多糖抑制氧化应激有关。

铁皮石斛； 神经保护作用； 氧化应激； PC12细胞

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种好发于中老年人的神经退行性疾病，其主要临床症状包括运动迟缓、姿势步态异常、肌强直和静止性震颤等[1]。PD的主要病理特征为中脑黑质致密部的多巴胺神经元的变性死亡[2]。采用1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)制备拟PD细胞模型是目前常用的方法，因为MPP+毒性对多巴胺神经元具有较强的选择性[3]。

铁皮石斛(dendrobium candidum,DC)是我国传统的名贵中药材，具有滋阴补肾、健脾养胃和润肺生津等功效，可用于糖尿病和慢性萎缩性胃炎等的治疗[4]。研究表明铁皮石斛能通过调节胰岛α和β细胞激素的分泌而发挥降血糖作用，可提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐量水平，还具有血管内皮细胞保护作用和肝脏保护作用[5-6]。但是铁皮石斛对神经损伤是否具有抑制作用以及作用机制尚不清楚。因此本文拟观察铁皮石斛对MPP+所致神经细胞损伤的抑制作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料铁皮石斛多糖由珍贵濒危药材湖南省工程研究中心提供；胎牛血清和DMEM高糖培养基购自Introgen公司；1-甲基-4-苯基吡啶离子、青霉素和链霉素购自Sigma公司；噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)为武汉博士德生物工程有限公司产品。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)为南京建成生物工程公司产品。

1.2细胞培养和分组高分化的PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。细胞采用含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基常规培养，细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，每两天换液一次，每四天传代一次。实验分对照组，损伤模型组，铁皮石斛多糖组(50、100、200和400 μg/mL)。损伤模型组细胞用含10 μmol/L MPP+的培养基处理细胞24 h；铁皮石斛多糖组，根据预实验的结果预处理2 h作用效果最好，因此细胞先用含50、100、200和400 μg/mL铁皮石斛多糖的培养基预处理2 h后，再加入MPP+(10 μmol/L)处理细胞24 h；对照组细胞给予等量生理盐水处理。

1.3 MTT法细胞活力的检测用胰酶消化后将PC12细胞制成细胞悬液，计数细胞密度，以1×104个细胞/孔接种到96孔培养板内。将细胞置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。在实验结束前4 h每孔加入100 μL MTT，使MTT的终浓度为0.5 mg /mL，继续培养4 h后吸去培养液。每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，待结晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶标仪上测定570 nm波长的吸光度值(OD值)。计算各组PC12细胞的存活率，每组设3个重复孔。

1.4 LDH活性的测定各组实验结束后，分别收集每组细胞培养液的上清液，测量各组细胞上清液中LDH活性，操作按LDH试剂盒说明书的要求进行。用酶标仪测定波长为450 nm的吸光度，每组设3个重复孔。

1.5 MDA和SOD水平的测定各组实验结束后，分别收集每组细胞，制备细胞匀浆，按试剂盒说明操作分别检测细胞中MDA水平和SOD的活性。BCA法测定细胞培养液上清中蛋白浓度，MDA的水平以每克细胞蛋白所含MDA的μmol数(μmol/gpr)表示；SOD的活性以每100 mg细胞蛋白所含SOD活性的U数(U/100 mgpr)表示。

2 结 果

2.1 MPP+和铁皮石斛多糖对PC12细胞存活率的影响采用MTT比色法检测PC12细胞活力，结果如图1所示：与对照组比较，MPP+处理PC12细胞的存活率显著降低(P<0.05)；与损伤模型组比较，200和400 μg/mL铁皮石斛多糖组PC12细胞的存活率均升高(均P<0.05)。50和100 μg/mL铁皮石斛多糖组PC12细胞的存活率与损伤模型组比较虽有升高，但差异无显著性(均P>0.05)。

图1 MPP+和铁皮石斛多糖对PC12细胞存活率的影响与对照组比较，*P<0.05；与损伤模型组比较，#P<0.05

2.2铁皮石斛多糖对MPP+诱导的PC12细胞培养液中LDH活性的影响图2所示：与对照组比较，MPP+诱导的PC12细胞培养液中LDH活性显著性升高(P<0.05)。与损伤模型组相比，200和400 μg/mL铁皮石斛多糖组，细胞培养液中LDH活性显著性降低(P<0.05)。50和100 μg/mL铁皮石斛多糖组细胞培养液中LDH活性与损伤模型组比较虽有降低，但差异无显著性(均P>0.05)。

图2 铁皮石斛多糖对MPP+诱导的PC12细胞培养液中LDH活性的影响 与对照组比较，*P<0.05；与损伤模型组比较，#P<0.05

2.3铁皮石斛多糖对MPP+诱导的PC12细胞中MDA和SOD水平的影响表1所示：与对照组比较，MPP+诱导的PC12细胞中MDA的含量显著升高，而SOD活性显著下降(均P<0.05)。与损伤模型组相比，200和400 μg/mL铁皮石斛多糖组细胞中MDA的含量显著降低，而SOD活性显著增加(均P<0.05)。但50和100 μg/mL铁皮石斛多糖组细胞中MDA水平和SOD活性与损伤模型组比较差异无显著性(均P>0.05)。

组别MDA(μmol/gpr)SOD(U/100mgpr)对照组45.64±7.82328.75±42.78损伤模型组134.71±12.45a85.72±10.15a铁皮石斛多糖(50μg/mL)128.25±9.0491.26±11.92铁皮石斛多糖(100μg/mL)117.86±11.38105.55±15.78铁皮石斛多糖(200μg/mL)91.34±7.25b186.24±18.33b铁皮石斛多糖(400μg/mL)52.17±6.89b276.91±23.69b

与对照组比较，a：P<0.05；与损伤模型组比较，b：P<0.05

3 讨 论

目前的研究认为黑质的多巴胺能神经元的变性是PD的核心病理变化。如何防止多巴胺能神经元的变性和损伤从而延缓甚至逆转PD的进程，已成为国内外有关PD治疗的研究重点和热点。由于MPP+毒性对多巴胺能神经元具有较强的选择性，因此是制备PD模型的经典药物。MPP+可通过干扰呼吸链引起线粒体功能障碍，还可导致氧化应激和激活caspase和蛋白激酶C影响快速轴浆运输并导致神经元突触功能失常，产生逆向性死亡的病理过程[7-8]。氧化应激在黑质的多巴胺能神经元的变性中发挥着重要的作用[9]，因此抑制氧化应激是保护多巴胺能神经元的重要途径。

石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛中的极品，它因表皮呈现铁绿色而得名。铁皮石斛是我国传统的名贵中药材，为多年生兰科附生草本植物。主要生于海拔达1 600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐-5 ℃的低温。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，属补益药中的补阴药。从药理学和植物化学成分分析表明铁皮石斛中主要的生物活性物质是多糖类化合物，且含量较高。据《中药志》记载铁皮石斛多糖具有“养阴益胃和生津止渴”的功效，在许多治疗糖尿病的中药方剂中也有大量采用铁皮石斛[10-11]。现代药理研究表明铁皮石斛多糖有提高机体抵抗力和免疫力、抗肿瘤和防治白内障等功能[12-13]。研究显示石斛类多糖具有抑制胰岛细胞凋亡和坏死，保护胰岛细胞而起到预防治疗糖尿病，并具有抵抗钙超载，抑制视网膜细胞凋亡的作用[14]。铁皮石斛多糖还具有血管内皮细胞保护作用和肝脏保护作用[6,15]。

本文结果显示铁皮石斛显著抑制了MPP+诱导的PC12细胞的损伤，表现为显著增加了PC12细胞的存活率和显著降低了细胞培养液中LDH的水平。铁皮石斛也显著抑制了MPP+诱导的PC12细胞中的氧化应激，表现为显著降低了细胞中MDA的含量和显著增加了细胞中SOD的活性。这些结果表明铁皮石斛对神经细胞的损伤具有抑制作用，其神经保护的机制可能是通过抑制氧化应激。

总之，铁皮石斛多糖对MPP+诱导的神经细胞的损伤具有抑制作用，其机制可能与铁皮石斛多糖的抗氧化作用有关。本文结果为延缓或逆转PD疾病进程开辟了新途径。

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InhibitoryEffectofPolysaccharidesfromCandidumDendrobiumontheInjuryInducedby1-methyl-4-phenylpyridiniuminPC12Cells

DONG Xin,LIAO Huiying,LU Suqin,et al

(DepartmentofInternalNeurology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of polysaccharides from candidum dendrobium on the injury induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) in PC12 cells.MethodsThe PC12 cells were divided into control,injury model and polysaccharides from candidum dendrobium (50,100,200 and 400 μg/mL) group.The cells were incubated with 10 μmol/L MPP+for 24 h to induce the injury in injury model group.After the cells were pretreated with polysaccharides from candidum dendrobium (50,100,200 and 400 μg/mL) for 2 hours,cells were incubated with 10 μmol/L MPP+for 24 h in polysaccharides from candidum dendrobium group.The cells were incubated with the same volume of saline in control group.MTT assay was used to detect the survival rate of cells.The level of lactate dehydrogenase (LDH) in the medium,the level of malondialdehyde (MDA) in the cells and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the cells were measured.ResultsCompared with the control group,the survival rate of cells was singificantly decreased,the level of LDH in the medium and MDA in the cells were singificantly increased,the activity of SOD in the cells was singificantly decreased in the injury model group.Compared with the injury model group,the survival rate of cells was singificantly increased,the level of LDH in the medium and MDA in the cells were singificantly decreased,the activity of SOD in the cells was singificantly increased in the polysaccharides from candidum dendrobium (200 and 400 μg/mL) group.Conclusion

Polysaccharides from candidum dendrobium inhibits the injury induced by MPP+in PC12 cells,of which the mechanism may be related to the inhibition of oxidative stress induced by polysaccharides from candidum dendrobium.

candidum dendrobium; neuroprotective effect; oxidative stress; PC12 cells

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.04.005

2014-12-02；

2015-04-15

衡阳市科技局课题(2012KJ22).

*通讯作者，E-mail：17490587@qq.com.

R741.05

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(此文编辑：蒋湘莲)