附子及附子干姜配伍对心衰大鼠血流动力学和cAMP-PKA信号转导通路的影响

附子及附子干姜配伍对心衰大鼠血流动力学和cAMP-PKA信号转导通路的影响

梁涛耿姗周玲玲葛华雯王新宇

(南京中医药大学药理教研室，江苏南京210023)

摘要〔〕目的研究附子和附子干姜配伍对心衰大鼠血流动力学和环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA) 信号转导通路的影响。方法采用盐酸普罗帕酮注射液静脉注射法建立心力衰竭动物模型，实验分为空白组、模型组、附子高、低剂量组(5、2.5 g/kg)、附子∶干姜(1∶1)高、低剂量组(10、5 g/kg)，记录左心室内压(LVSP)、左心室内压最大上升/下降速率(±LVdp/dtmax)；采用酶联免疫吸附法检测心脏组织中cAMP、PKA的含量。结果与模型组比较，给药组均可以升高LVSP和±LVdp/dtmax，其中附子∶干姜(1∶1)高剂量组效果最显著；与模型组比较，各组给药后心脏组织中cAMP和PKA含量均增加，其中附子∶干姜(1∶1)高剂量组最显著。结论附子干姜配伍有明显的抗心衰作用，可升高心肌组织cAMP、PKA含量，这可能是其作用机制之一。

关键词〔〕附子；干姜；血流动力学；环磷酸腺苷；蛋白激酶A

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金预研基金(12XYY08)；江苏省科技厅科技支撑计划(BE2012762)；江苏省优势学科建设工程资助项目

第一作者：梁涛(1973-)，女，博士，副教授，主要从事心血管药理研究。

Effect of aconite and compatibility of aconite dried ginger on hemodynamic parameters and cAMP-PKA signal transduction pathways in rat of chronic heart failure

LIANG Tao, GENG Shan,ZHOU Ling-Ling,etal.

Department of Pharmacology, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210023,Jiangsu, China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of aconite and compatibility of aconite dried ginger on hemodynamic parameters and cylic adenosine monophsphate(cAMP)-protein kinase A(PKA) signal transduction pathways in rat of chronic heart failure.MethodsThe acute heart failure rat animal model was established by propafenone hydrochloride injection venous injection method.The SD rats were randomly divided into normal, model, aconite(5, 2.5 g/kg), compatibility of aconite dried ginger (1∶1) group (10, 5 g/kg). The hemodynamic parameters left ventricular systolic pressure(LVSP) and maximal derivative of left ventricular pressure(±LVdp/dtmax) were measured.Through ELISA kit, the contents of rat heart tissue cAMP and PKA were detected. ResultsThe levels of LVSP and ±LVdp/dtmax were increased significantly in all groups, the contents of cAMP and PKA were significantly increased. Compatibility of aconite dried ginger had more significant effect in the high dose group. ConclusionsCompatibility of FG has curative effects to acute heart failure, the mechanism may be related to increasing the contents of cAMP and PKA.

【Key words】Aconite; Dried ginger; Hemodynamics; Cylic adenosine monophsphate(cAMP); Protein kinase A(PKA)

附子与干姜同属辛热，两者辛热同施，是热热配伍的典型代表〔1〕。研究表明，附子干姜均具有扩张血管、升高血压等作用，两者配伍还具有促进胃肠蠕动等温通作用〔2～4〕。本实验观察附子与干姜附子配伍对心衰大鼠血流动力学的影响，探讨附子干姜温通心阳的作用机制，从现代科学角度阐明中药配伍的药性。

1材料与方法

1.1动物SD大鼠60只，雌雄各半，体重200～220 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供〔SCXK(沪)：2007-0005〕。饲养条件：室温(22±2)℃，湿度40%～60%。

1.2药物与试剂附子(黑顺片)(批号：20130512，南京解放军第454医院药剂科)，干姜(批号：20130512，南京解放军第454医院药剂科)；附子质控标准：含乌头碱(C34H47NO11)，不得少于1.0%；干姜质控指标：含挥发油不得少于0.8% ml/g，含6-姜辣素不得少于0.6%。盐酸普鲁帕酮注射液(批号：100919，上海爱紫特生物科技有限公司)；环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒(批号：20130514)、蛋白激酶A(PKA)试剂盒(批号：20130612)均购自南京建成生物工程研究所。

1.3附子及附子干姜配伍液制备方法附子高剂量组：称取附子500 g，加10倍量水浸泡30 min，煎煮1 h过滤，连续煎煮3次，合并3次滤液，于水浴锅上浓缩，浓缩到每1 ml相当于生药0.5 g。附子低剂量：取附子高剂量药液稀释1/2即得。附子干姜配伍(1∶1)高剂量：称取附子、干姜各500 g，加10倍量水浸泡30 min，煎煮1 h过滤，连续煎煮3次，合并3次滤液，于水浴锅上浓缩，浓缩至每1 ml相当于生药1 g。附子干姜配伍低剂量：取附子干姜高剂量药液稀释1/2即得。

1.4仪器MP-150生理记录仪(美国Biopac公司)，MP-2003注射泵(上海雷恩医疗器械有限公司)，JY4001电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，HT酶标仪(美国Bio-Tek)，XHF-D匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.5方法

1.5.1大鼠心衰模型建立取健康SD大鼠60只，随机分组。20%乌拉坦腹腔注射麻醉，仰卧位固定四肢，于颈部腹侧偏右纵向切开皮肤，在胸锁乳突肌内侧分离右颈总动脉1.5 cm，立即结扎远心端，动脉夹夹住近心端，经颈动脉插入充满肝素的左室导管，松紧度应以切口处不漏血，导管又能自由进出为度。左手用镊子夹住颈总动脉及导管，右手将导管插入左室腔，感到导管随心脏搏动而明显抖动时，则应减慢插进速度。当显示器上的波形由血压波变成下沿达0 mmHg附近、具有明显舒张期且峰顶平坦的波形时表明导管已经通过主动脉瓣进入左室腔，继续送入导管约0.2～0.3 cm，所有信号均同步记录于生理记录仪上〔5〕。待观察稳定后舌下静脉快速推注普鲁帕酮注射液(10.5 mg/kg)，待动物+dp/dtmax下降至给药前的20%～40%后以恒流泵股静脉恒速注射普鲁帕酮注射液(2.6 mg/kg)，急性心衰模型稳定5 min以上视为模型成功。

1.5.2大鼠分组与给药造模成功后，经十二指肠给药，空白和模型组给予0.9%生理盐水，附子高、低剂量组(5，2.5 g/kg)和附子∶干姜(1∶1)高、低剂量组(10，5 g/kg)的给药体积均为10 ml/kg。

1.5.3血流动力学指标检测观察给药后10、20、30、60 min，各组左心室收缩压(LVSP)和左心室内压最大上升和下降速率(±LVdp/dtmax)。

1.5.4取材给药60 min后处死大鼠，取各组心脏称重，取0.5 g心脏组织加入10 ml预冷生理盐水，采用内切式组织匀浆机匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清即得心脏组织匀浆液。

1.5.5心脏组织cAMP、PKA的检测采用酶联免疫吸附法检测，具体方法参照试剂盒说明书。

1.6统计学处理采用SPSS11.0软件进行方差分析。

2结果

2.1对左心室内压最大上升速率的影响与模型组比较，各给药组均有升高+dp/dtmax的作用(P<0.05或P<0.01)，附子高剂量组效果强于低剂量组，附子干姜高剂量组效果强于低剂量组，附子干姜高剂量组作用维持时间长，见表1。

2.2对左心室内压最大下降速率的影响与模型组比较，给药后各组均有抑制-dp/dtmax下降的作用(P<0.05或P<0.01)。附子干姜高剂量组抑制作用最为明显、维持时间长，但起效较附子高剂量组慢，见表2。

2.3对左心室内压的影响与模型组比较，各给药组LVSP 均上升(P<0.05 或P<0.01)。附子干姜高剂量组LVSP上升最明显、维持时间长，效果最好，但起效较附子高剂量组慢，见表3。

2.4对心脏组织匀浆中cAMP、PKA含量的影响与模型组比较，各给药组心脏组织中cAMP和PKA含量均有所增加(P<0.05或P<0.01)，其中附子干姜高剂量组的心脏组织中cAMP和PKA含量增加最显著，见表4。

表1　各组心衰大鼠左心室内压最大上升速率变化 ± s， n=10)

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　各组心衰大鼠左心室内压最大下降速率变化 ± s， n=10)

表3　各组心衰大鼠左心室内压变化 ± s， n=10)

表4　各组心衰大鼠心脏组织cAMP、PKA含量

3讨论

±LVdp/dtmax可一定程度上反映室壁张力的变化速率。+LVdp/dtmax是评价心肌收缩性能的常用指标，-LVdp/dtmax是心肌舒张参数，可作为评价心室舒张功能的指标之一。LVSP为等容收缩期左心室内压力峰值，当心肌收缩力加强时LVSP上升〔6〕。干姜与附子相伍可改善冠脉血流量，加快心率，改善心衰大鼠的血流动力学。同时，干姜可明显拮抗附子对心脏的毒性，减少心肌能量需求，达到回阳救逆的目的〔7〕。

cAMP-PKA信号转导通路对心肌细胞收缩有重要影响。cAMP通过激活PKA使其靶细胞发生蛋白质磷酸化级联反应，进而调节代谢、基因表达及细胞反应。在心肌细胞内，PKA 可以使Ca2+通道磷酸化，导致Ca2+通道开放，细胞内Ca2+浓度升高，增强心肌收缩力。在心力衰竭的心肌细胞内钙池里的Ca2+释放障碍，胞质网膜对Ca2+的通透性降低，Ca2+内流减少，抑制腺苷酸环化酶(AC)，促使第二信使产生抑制效应，cAMP被激活量减少，PKA随之减少。附子可通过升高大鼠心肌cAMP、PKA含量，提高大鼠心脏收缩能力〔8，9〕。

本实验结果表明，附子∶干姜(1∶1)高剂量组中cAMP和PKA含量明显升高，附子配伍干姜改善心衰大鼠血流动力学的机制可能与G蛋白介导的细胞信号转导途径cAMP-PKA有关。

4参考文献

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5张宏，彭成，展海霞，等.一种大鼠急性心力衰竭动物模型的建立方法〔J〕.四川动物，2008；27(2)：296-8.

6展海霞，彭成.附子与干姜配伍对心衰大鼠血流动力学的影响〔J〕.中药药理与临床，2006；22(1)：42-4.

7奚丽君，陈卫平.附子与干姜配伍增效减毒作用机制研究概述〔J〕.实用中医药杂志，2008；24(9)：608-10.

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〔2014-09-17修回〕

(编辑郭菁)