多重PCR结合飞行质谱技术检测40%非缓冲甲醛固定组织中的降解DNA



多重PCR结合飞行质谱技术检测
40%非缓冲甲醛固定组织中的降解DNA

柳燕，李莉，林源，赵珍敏

（司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063）

摘要：目的利用多重PCR结合飞行质谱技术（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)检测40 %非缓冲甲醛固定组织中降解DNA的SNP位点，提高微量降解检材DNA的检测时限，评估法医学应用效能。方法提取保存在非缓冲40 %甲醛溶液中不同天数的人体组织DNA，用MALDI-TOF MS技术平台检测自行设计的67个X-SNP位点。STR和miniSTR位点的检测时限评估用AmpFSTR identifiler和AmpFSTR MiniFiler试剂盒完成。结果40%非缓冲甲醛固定组织的STR和miniSTR位点检测时限分别为7 d和15 d；用MALDI-TOF MS技术平台检测67个X-SNP位点，检测片段均小于105bp，其中44个独立遗传X-SNP位点的检测时限可达44d。结论MALDITOF MS技术平台检测X-SNP位点可明显提高降解DNA样本的检测能力。

关键词：法医遗传学；单核苷酸多态性；降解DNA；非缓冲甲醛固定液；聚合酶链反应；飞行质谱技术

众所周知，甲醛在空气中逐渐被氧化呈现的酸性环境对DNA双链有着极强烈的破坏性，40 %非缓冲甲醛固定组织中的DNA片段会随着固定时间的延长而逐渐脆性增加被降解。DNA扩增片段长度逐渐下降，其降解程度直接影响法医DNA的分型检测成功率。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)是新近发展起来的一种简单而高效的软电离生物质谱技术，其主要用途之一就是可以对基因的单核苷酸多态性进行分析。本文在多重PCR结合飞行质谱技术平台上，以X-SNP作为检测标记，尝试检测超过STR检测时限的40 %非缓冲甲醛固定组织，以期提高法医实践中极度降解DNA的检测成功率。

1　材料与方法

1.1样品和DNA提取

操作：在40 %甲醛溶液中固定保存了不同天数（4、7、15、37、44 d）的人体器官组织（心、脑、肝、脾、肾、肺、胃、肠），用蒸馏水淋洗干净后，按QIAGEN公司“QIAamp DNA mini试剂盒”提取DNA。

1.2常染色体STR基因座分型

采用Identifiler和MiniFiler试剂盒在3100XL遗传分析仪（美国AB公司）上对DNA提取液分别进行15个STR和9个miniSTR的片段分型检测，观察经不同时间40 %非缓冲甲醛固定液固定后人体组织的可检测STR基因座，分析DNA片段降解情况。

1.3 SNP位点的选择

参考文献按[1]合成67个X-SNP位点的引物并进行PCR扩增。

1.4 SNP分型

所有反应均在9700扩增仪（美国AB公司）上进行，以水代替模板作为阴性对照。

1.4.1多重复合PCR

67个SNP位点的目标序列分别由3个17重和1 个16重共计4组复合PCR反应完成。扩增体系为5 μL，包含10×PCR缓冲液0.625μL、2.5mmol/L dNTP 1μL、25mmol/L MgCl20.325μL、引物1μL、纯水0.95μL、10 ng/μL DNA 1 μL、5 U/μL热启动Taq酶0.1 μL。PCR条件为94℃15 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1min，45次循环；72℃3min。

1.4.2虾碱性磷酸酶反应

PCR扩增产物经虾碱性磷酸酶处理，去除多余dNTP。反应体系组成为：1 U/μL SAP 0.3μL、10×SAP缓冲液0.17μL、纯水1.53μL，保温37℃40min、85℃15min。

1.4.3单碱基引物延伸反应

单碱基引物延伸反应体积为2 μL，包含10×iPlex缓冲液0.2 μL，iPlex终止反应液0.1 μL，iPlex酶0.0205μL，纯水0.7395μL，0.94μL延伸引物。反应程序为：94℃30s；52℃5s，80℃5s，5次循环；94℃5s，52℃5 s，80℃5 s，40次循环；72℃3 min。延伸产物用阳离子交换树脂去盐纯化。

1.4.4基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

用384微孔板（美国西格诺公司）的自动点样器将待测样品点至MassARRAY光谱检测芯片上，推入检测室进行检测，检测质量范围设定为3920～12023道尔顿，SNP位点的分型用MassARRAY TYPER分析软件（version 4.0)完成。

2　结果

2.1 40 %非缓冲甲醛溶液中固定组织的STR检测时限

在40 %甲醛溶液中固定7 d后，用AmpFSTR identifiler试剂盒检测的常染色体STR开始降解而不能获得完整图谱信息；固定15d后，用MiniFiler kit检测的mini STR开始降解而不能获得完整图谱信息。固定37~44d后，无法获得有用的STR信息。

2.2 40%甲醛溶液中固定组织的SNP检测时限40%非缓冲甲醛固定组织的SNP检测时限随着组织在固定剂中固定时间的延长，越来越多的SNP位点发生碱基的错检或漏检。固定15 d后，1个位点（rs5926442）出现错检；固定37d后，4个位点（rs5926442，rs1229078，rs12840669，rs2214174）出现错检；固定44d后，12个位点出现错检（见表1）。

表1　发生错误分型的SNP位点在被检测组织中的发生时间　（d）

续表1

3　讨论

非缓冲甲醛固定剂在室温下极容易被氧化成甲酸，后者修饰和破坏人体组织DNA，导致DNA提取困难、脆性增加和断裂降解及PCR抑制作用。随着组织在福尔马林液中固定时间的延长，其DNA扩增片段长度逐渐下降。因此组织在非缓冲福尔马林中的固定时间是影响DNA检测成功与否的关键因素。

AmpFSTR identifiler和AmpFSTR MiniFiler kit是美国AB公司研发的在使用比较普遍STR扩增检测试剂盒，前者DNA扩增片段长度要达到350 bp，后者DNA扩增片段长度一般要达到250 bp。40 %非缓冲甲醛固定剂固定在4 d以内的各种人体组织DNA片段长度均能达到350 bp以上，用AmpFSTR identifiler试剂盒可检测到全部STR位点。超过4d后，对40%非缓冲甲醛固定剂抗性较差的肝、肠等组织DNA片段开始由长片段到小片段降解，固定9 d后，STR位点检出率仅为50%[3]。在15d以内的福尔马林固定时间下，各种人体组织的DNA片段长度能达到200 bp以上，对降解检材而言，此时的miniSTR检测可以对常规STR检测起到很好的补充作用。超过此检测时限，miniSTR的检测位点也发生信息大量丢失的情况。所以，要解决非缓冲福尔马林固定组织中高度降解DNA的检测成功率需要开发更多片段长度更短小的检测系统。

本研究中采用的X-SNP分型技术平台是多重PCR结合飞行质谱技术，通过PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异性单碱基延伸引物，获得小于105 bp的DNA扩增片段，适合应用于超过miniSTR检测时限、高度降解的小片段DNA分型检测。在40%非缓冲甲醛固定剂中固定15 d后，所选择的67个SNP位点，除rs5926442以外，均可得到正确分型结果，rs5926442位点从组织固定15 d后就在心、肝、脾、肾、肠样品中发生了T碱基的漏检，分型从杂合子CT被错检成C，该位点对样品质量的要求高于其他位点。其他位点对40 %非缓冲甲醛固定组织的正确分型力则随着组织固定时间的延长有规律地减少。当固定时间超过37 d，可观察到肝、肠组织又有3个位点（rs1229078，rs12840669、rs2214174）发生了错检或漏检，至固定44 d，更多组织的其他9个位点发生错检或漏检。综合考虑67个X-SNP在汉族人群中的多态性分布、在X染色体上的连锁程度以及各SNP位点在本检测平台上对高度降解DNA样品质量的耐受度等，最后确定1个44X-SNP检测系统，其在男性群体和女性群体中的累积个体识别率、二联体和三联体的非父排除率均可达到法医学实践应用标准，对非缓冲福尔马林固定人体组织的检测时限从miniSTR的15d提高到44d。

[1]Li Li，Yan Liu，Yuan Lin. Typing of 67 SNP Loci on X Chromosome by PCR and MALDI-TOF MS[J]. Research in Genetics 2015，（10）：27-35.

[2]李莉，柳燕，林源，等. 67个X-SNP位点的分型检测和连锁不平衡检验[J].法医学杂志，2011，27（5）：337-341.

[3]柳燕，李莉，赵珍敏，等.人体组织在非缓冲福尔马林固定剂中的STR检测时限[J].中国法医学杂志，2010，25（1）：1-5.

（本文编辑：李成涛）

鉴定制度

Forensic System

X-SNP Typing of Degraded DNA from Formalin-fixed Tissues by MALDI-TOF MS

LIU Yan，LI Li，LIN Yuan，ZHAO Zhen-min

（Shanghai Key Laboratory of Forensic Science，Institute of Forensic Sciences，Ministry of Justice，Shanghai 200063，China）

Abstract:Objective To develop an applicable，high resolution X-SNP typing method for extremely degraded DNA from unbuffered formalin-fixed human tissues. Method Various tissues (heart，brain，liver，spleen，kidney，lung，stomach and intestine) obtained from autopsy were immersed in unbuffered formalin at room temperatures and sampled at regular intervals. DNA was extracted by the QIAamp kit，the primers were designed by the MassARRAY Assay Design software (Sequenom Inc.). Multiplex PCR was carried out in four amplification reactions and the related polymorphic sites were extended by the allelespecific primer and analyzed by the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDITOF MS). Meanwhile，STR typing was also carried out by AmpFSTR identifiler and AmpFSTR MiniFiler. Results All the amplicons of 67 X -SNP loci were shorter than 105 bp. Among them，44 showed independent inheritance and high polymorphisms in Chinese Han population. The set of 44 X-SNP could be used to detect badly degraded DNA from tissues preserved in unbuffered formalin in up to 44 day. The combined discrimination power and the combined exclusion probabilities in both trio and duo case were more than 0.9999. STR and mini STR typing were not detectable in tissues that were preserved in unbuffered formalin for over 7 days and 15 days，respectively. Conclusion X-SNP typing with MALDITOF MS is a useful tool for detecting extremely degraded DNA which has shorter PCR amplicon. It can be applied in forensic personal identity and paternity test，especially in sister's kinship or grandmother-daughter's kinship cases in which alleged father is not available.

Key words:forensic genetics; single nucleotide polymorphisms; degraded DNA; unbuffered formalin; PCR; MALID-TOF.

作者简介：柳燕（1963—），女，主任法医师，主要从事法医物证学鉴定工作。E－mail：Liny@ssfjd.cn。

基金项目：上海市法医学重点实验室资助（14DZ2270800）

收稿日期：2015-06-20

文章编号：1671-2072-（2015）05-0041-03

doi:10.3969/j.issn.1671-2072.2015.05.007

文献标志码:A

中图分类号：DF795.4