斑蝥酸钠维生素B6对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖抑制作用

斑蝥酸钠维生素B6对人卵巢癌细胞株SKOV3 的增殖抑制作用

关永红祁盛昆1刘贤英

(吉林大学第二医院，吉林长春130041)

摘要〔〕目的观察斑蝥酸钠维生素B6对体外培养的人卵巢癌细胞株(SKOV3细胞)的增殖抑制率、凋亡率及其对细胞周期的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6对SKOV3细胞的增殖抑制率。流式细胞仪定量检测经斑蝥酸钠维生素B6作用后的SKOV3细胞周期进程的变化及凋亡率。结果不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对SKOV3细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞仪结果显示G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，SKOV3细胞凋亡率升高。结论斑蝥酸钠维生素B6制剂对SKOV3细胞生长增殖有显著的抑制作用,抑制SKOV3细胞G1期向S期转化进程，从而使S期细胞减少，造成G2/M期细胞相对增多，诱导SKOV3细胞凋亡。

关键词〔〕SKOV3细胞；斑蝥酸钠；细胞周期；凋亡

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

通讯作者：刘贤英(1966-)，女，副主任护师，主要从事妇科肿瘤研究。

1吉林大学临床医学院2012级

第一作者：关永红(1966-)，女，主治医师，主要从事妇科肿瘤研究。

卵巢癌是因早期缺乏特异性的诊断指标，当患者出现症状和体征时往往已进展到晚期。因此，寻求卵巢癌治疗的有效药物具有重要意义。斑蝥酸钠系斑蝥的主要抗肿瘤活性成分——斑蝥素的半合成衍生物〔1〕，用于中晚期肝癌、胃癌、肾癌及宫颈癌等治疗，获得较为满意的结果。本研究应用人卵巢癌细胞株(SKOV3)为靶点，体外观察不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对SKOV3细胞增殖抑制率及细胞周期进程的变化，旨在为人卵巢癌的治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料SKOV3细胞株购于上海复旦大学细胞库，四甲基偶氮唑蓝(MTT试剂)RPMI1640培养基购于美国sigma公司，斑蝥酸钠维生素B6注射液10 ml/支，内含斑蝥酸钠0.1 mg，维生素B6 25 mg，贵州柏强制药有限公司生产，胎牛血清购自长春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法取对数生长期的SKOV3细胞，应用0.25%胰蛋白酶消化，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内，100 μl/孔静止培养。当细胞生长达到80%汇合时，按加入斑蝥酸钠浓度分为0 μg/ml组(对照组)、1.0 μg/ml组、20 μg/ml组、4.0 μg/ml及8.0 μg/ml，每个浓度10复孔，置37℃ 5%二氧化碳培养箱内静止培养24 h，结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后，弃去上清，每孔内加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡5 min，使MTT还原产物完全溶解。应用酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度A值，计算SKOV3细胞增殖抑制率，每组试验重复3次，取平均值。SKOV3细胞抑制率=(1-加药孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%。

1.2.2流式细胞术细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔塑料培养板改为25 ml培养瓶进行。每个浓度3瓶，培养结束后用0.25%胰白蛋白酶消化，收集细胞磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70% 冷乙醇固定，4℃内保存。上机前过40目网，调细胞数1×106/ml,PI染色，流式细胞仪检测细胞周期，结果以Moidff2.0软件分析。

1.3统计学处理采用SPSS11.0软件行t检验。

2结果

2.1MTT结果不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6对SKOV3细胞增殖均有影响，且呈剂量依赖性，与对照组相比差异显著(P<0.01)；其中对照组A值1.36；1 μg/ml组A值1.24，抑制率8.9%；2 μg/ml组A值1.11，抑制率18.4%；4 μg/ml组分别为0.89，34.6%；8 μg/ml组为0.82，39.7%。

2.2流式细胞仪结果不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对SKOV3 细胞周期进程均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，细胞凋亡率升高，组间比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1　不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对SKOV3细胞

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

3讨论

随着分子生物学技术的发展，人们已认识到恶性肿瘤的本质在于细胞周期的调节失控，使本来应脱离细胞周期而停止增殖或应自行凋亡的细胞不断地进入细胞周期，从而出现无限制、自主的细胞增殖和分裂，最终导致肿瘤〔2〕。 斑蝥酸钠维生素B6是一种广谱的抗癌新药〔3〕，是斑蝥素的衍生物，他保持了斑蝥素特有的抗癌活性，而毒副作用比斑蝥素小，其抗癌机制是抑制肿瘤细胞蛋白质的合成，降低肿瘤细胞CAMP的活性，抑制肿瘤DNA、RNA及前体的渗入，从而使肿瘤细胞的形态和功能发生改变〔4〕。

流式细胞仪结果显示，不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6制剂对SKOV3细胞周期各时相进程均有影响。细胞周期是由G1、S、G2/M期所组成的一个复杂过程，其进程受各种细胞因子的严格控制，其中任何一个环节失控即可发生形态学改变，实验结果显示，斑蝥酸钠维生素B6制剂可阻滞SKOV3细胞G1期向S期转化进程，G1期细胞堆积，不能进入S期，造成G1期细胞增多，G1期细胞是制造和产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，而且G1期糖原合成最为显著。同时G1期也是化学药物作用的敏感点〔5〕，因此，抑制细胞G1期的RNA合成，从而使肿瘤细胞增殖变缓。本研究结果显示由于G1期细胞堆积，造成S期细胞减少，从而使G2/M期细胞相对增多。G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反映〔6〕,这一点从细胞形态学和细胞凋亡率上得到了体现。

综上所述，斑蝥酸钠维生素B6作为抗癌药物，不仅能直接抑制肿瘤细胞生长和增殖。也可通过抑制肿瘤细胞周期进程的变化，实现肿瘤细胞逆转，且随着药物浓度增加和时间的延长抑制作用明显，呈时间一剂量依赖关系，但斑蝥酸钠的抗肿瘤的机制是多方面的，有待进一步研究。

4参考文献

1刘展华，曹洋，陈锐深，等.斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖的抑制作用〔J〕.中药新药与临床药理，2008；19(1)：32-3.

2赵珍珍,李俊,王维刚,等.不同癌细胞系对斑蝥酸钠的药物敏感性检测〔J〕.同济大学学报(医学版)，2013;34(4)：10-5.

3刘忠虎,陈艾江,马新刚,等.斑蝥酸钠维生素B6注射液辅以胸腔镜内脏神经切断术治疗癌腹痛〔J〕.国际肿瘤学杂志，2013;40(5)：398-9.

4Murthy SC,Mason DP，Raja S，etal. Malignant pleural effusion:one size does not fit all〔J〕.Ann Thorac Surg,2013;96(4):1525-6.

5Brted J,Ludas J.Mammalian G1and S-phase checkpoints in reponse to DNA damage 〔J〕.J Curr Opin Cell Biol,2001;13(6):734-47.

6Eillnger Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK),a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells,2000;5(6):491-8.

〔2014-05-17修回〕

(编辑李相军/滕欣航)